第11章蛋白质的生物合成.ppt

生物化学生物化学CAICAI课件课件A A第第1111章章 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成作者 高新旺 祁新芝河南省周口卫校目录目录参与蛋白质生物合成的物质参与蛋白质生物合成的物质蛋白质生物合成过程蛋白质生物合成过程  重点内容：三种重点内容：三种RNARNA在蛋白质生物合成在蛋白质生物合成中的作用、核蛋白体循环中的作用、核蛋白体循环学习目标学习目标复习题复习题学习目标1.简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用2.写出蛋白质合成的步骤和核蛋白体循环的阶段3.图示基因操纵子调节学时分配：2学时第一节第一节 参与蛋白质生物合成的物质参与蛋白质生物合成的物质         参与蛋白质生物合成的物质有：参与蛋白质生物合成的物质有：①① mRNA：：作为蛋白质生物合成的模板，决定作为蛋白质生物合成的模板，决定多肽链中氨基酸的排列顺序；多肽链中氨基酸的排列顺序；②② tRNA：：搬运氨基酸的工具；搬运氨基酸的工具；③③ rRNA：：与蛋白质结合为核蛋白体，是蛋白与蛋白质结合为核蛋白体，是蛋白质生物合成的场所；质生物合成的场所；④④ 酶及其他蛋白质因子；酶及其他蛋白质因子；⑤⑤ 供能物质及无机离子。

供能物质及无机离子 一、一、mRNA 作为指导蛋白质生物合成的模板作为指导蛋白质生物合成的模板          mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码，共有密码，共有64种不同的密码其中种不同的密码其中AUG编码甲编码甲硫氨酸，又可作为蛋白质合成的起始信号，称硫氨酸，又可作为蛋白质合成的起始信号，称为起始密码而为起始密码而UAA、、UAG、、UGA不编码任何不编码任何氨基酸，只作为肽链合成的终止信号，称为终氨基酸，只作为肽链合成的终止信号，称为终止密码止密码（见下页密码表）（见下页密码表）         遗传密码表遗传密码表UCAG         缬缬GUU缬缬GUC缬缬GUA缬缬GUG丙丙GCU丙丙GCC丙丙GCA丙丙GCG天冬氨天冬氨GAU天冬氨天冬氨GAC谷谷GAA谷谷GAG 第一核苷酸第一核苷酸    （（5’））第二核苷酸第二核苷酸第三核苷酸第三核苷酸    （（3’））UCAGUCA  G苯丙苯丙UUU苯丙苯丙UUC亮亮UUA亮亮UUG亮亮CUU亮亮CUC亮亮CUA亮亮CUG异亮异亮AUU异亮异亮AUC异亮异亮AUA甲硫甲硫AUG丝丝UCU丝丝UCC丝丝UCA丝丝UCG脯脯CCU脯脯CCC脯脯CCA脯脯CCG苏苏ACU苏苏ACC苏苏ACA苏苏ACG酪酪UAU酪酪UAＣＣ终止终止UAA终止终止UAG组组CAU组组CAC谷氨谷氨CAA谷氨谷氨CAG天冬天冬AAU天冬天冬AAC赖赖AAA赖赖AAG半胱半胱UGU半胱半胱UGC终止终止UGA色色UGG精精CGU精精CGC精精CGA精精CGG丝丝AGU丝丝AGC精精AGA精精AGG　　　　U　　　　    C　　　　A　　　　G　　　　　　　　　　　　UCAG　　　　UCAG甘甘GGU甘甘GGC甘甘GGA甘甘GGG二、二、tRNA         在氨基酸在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的合成酶催化下，特定的tRNA可可与相应的与相应的 氨基酸结合，生成氨基酰氨基酸结合，生成氨基酰tRNA，，从而携带从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。

氨基酸参与蛋白质的生物合成 tRNA的反密码可以的反密码可以识别识别mRNA上相应的密码上相应的密码（见下页图）（见下页图）            反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即则，即A对对U，，G对对C           能够识别能够识别mRNA中中5′端起动密码端起动密码AUG的的tRNA是是一种特殊的一种特殊的tRNA，，称为起称为起 动动tRNA在原核生物中，在原核生物中，起动起动tRNA是一种携带甲酰蛋氨酸的是一种携带甲酰蛋氨酸的tRNA；；而在真核而在真核生物中，起动生物中，起动tRNA是一种携带蛋氨酸的是一种携带蛋氨酸的tRNA 在在原核生物和真核生物中，均存在另一种携带蛋氨酸的原核生物和真核生物中，均存在另一种携带蛋氨酸的tRNA，，识别非起动部位的蛋氨酸密码，识别非起动部位的蛋氨酸密码，AUG 下图：密码子与反密码子的碱基配对ACAUAC蛋5'3'5'反密码蛋氨酰tRNAmRNAAUGGUU三、rRNA和核蛋白体        真核生物中的核蛋白体大小为真核生物中的核蛋白体大小为80S，，分为分为40S小亚基小亚基和和60S大亚基大亚基。

小亚基由小亚基由18S rRNA和和30多种蛋白质构成，大亚基则由多种蛋白质构成，大亚基则由5S rRNA、、28S rRNA和和50多种蛋白质构成（如下图）多种蛋白质构成（如下图） 大亚基小亚基上图：核蛋白体示意图给位给位 受位受位核蛋白体的大、小亚基具有不同的功能：核蛋白体的大、小亚基具有不同的功能：1．小亚基：可与．小亚基：可与mRNA、、GTP和起动和起动tRNA结合 2．大亚基：．大亚基：①①具有两个具有两个tRNA结合点A位（位（ 受位），受位），可与新进入的氨基酰可与新进入的氨基酰tRNA结合；结合；P位（给位），可与位（给位），可与延伸中的肽酰基延伸中的肽酰基tRNA结合②②具有转肽酶活性：将给位上的肽酰基转移给受位上具有转肽酶活性：将给位上的肽酰基转移给受位上的氨基酰的氨基酰tRNA，，形成肽键形成肽键③③具有具有GTP酶活性，水解酶活性，水解GTP，，获得能量获得能量 ④④具有起动因子、延长因子及释放因子的结合部位具有起动因子、延长因子及释放因子的结合部位       在蛋白质生物合成过程中，常常由若干核蛋白体结在蛋白质生物合成过程中，常常由若干核蛋白体结合在同一合在同一mRNA分子上，同时进行翻译，每两个相邻核分子上，同时进行翻译，每两个相邻核蛋白体之间存在一定的间隔，形成念珠状结构，称为多蛋白体之间存在一定的间隔，形成念珠状结构，称为多核蛋白体循环（见下页图）。

核蛋白体循环（见下页图） 3′mRNA5′下图：多核蛋白体循环给位给位 受位受位四、起动因子（四、起动因子（IF））          这是一些与多肽链合成起动有关的蛋白因这是一些与多肽链合成起动有关的蛋白因子在真核生物中存在子在真核生物中存在9种起动因子（种起动因子（eIF）其作用主要是促进核蛋白体小亚基与起动其作用主要是促进核蛋白体小亚基与起动tRNA及模板及模板mRNA结合  五、延长因子（五、延长因子（EF）） 真核生物中存在真核生物中存在2种（种（EF1，，EF2）其作用主要促使氨基酰用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的受体，并进入核蛋白的受体，并可促进移位过程可促进移位过程                         七、氨基酰七、氨基酰tRNA合成酶合成酶       该酶存在于胞液中，与特异氨基酸的活化以该酶存在于胞液中，与特异氨基酸的活化以及氨基酰及氨基酰tRNA的合成有关每种氨基酰的合成有关每种氨基酰tRNA合合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种tRNA具具有高度特异性，这是保证有高度特异性，这是保证tRNA能够携带正确的氨能够携带正确的氨基酸对号入座的必要条件。

基酸对号入座的必要条件 六、释放因子（六、释放因子（RF）） 其主要作用是识别终止密码，协助多肽链的其主要作用是识别终止密码，协助多肽链的释放八、供能物质和无机离子八、供能物质和无机离子      多肽链合成时，需多肽链合成时，需ATP、、GTP作为供能物作为供能物质，并需质，并需Mg2+、、K+参与 氨基酸活化时需消氨基酸活化时需消耗耗2分子高能磷酸键，肽键形成时又消耗分子高能磷酸键，肽键形成时又消耗2分子分子高能磷酸键，故缩合一分子氨基酸残基需消耗高能磷酸键，故缩合一分子氨基酸残基需消耗4分子高能磷酸键分子高能磷酸键   第二节第二节 蛋白质生物合成过程蛋白质生物合成过程 蛋白质生物合成过程包括三大步骤：蛋白质生物合成过程包括三大步骤：①①氨基酸的活化与搬运；氨基酸的活化与搬运；②②活化氨基酸在核蛋白体上的缩合；活化氨基酸在核蛋白体上的缩合；③③多肽链合成后的加工修饰多肽链合成后的加工修饰 一、氨基酸的活化与搬运一、氨基酸的活化与搬运         氨基酸与氨基酸与tRNA结合为氨基酰结合为氨基酰tRNA的过的过程称为氨基酸的活化，由氨基酰程称为氨基酸的活化，由氨基酰-tRNA合成酶合成酶催化完成。

其反应过程为：催化完成其反应过程为： 氨基酸氨基酸  + tRNA  氨基酰氨基酰-tRNA  氨基酰氨基酰-tRNA合成酶合成酶ATPAMP + PPi       在此反应中，特异的在此反应中，特异的tRNA3′端端CCA上的上的2 ′或或3 ′位自由羟基与相应的活化氨基酸以位自由羟基与相应的活化氨基酸以酯键相连接，形成氨基酰酯键相连接，形成氨基酰tRNA，，从而使活化从而使活化氨基酸能够被搬运至核蛋白体上参与多肽链的氨基酸能够被搬运至核蛋白体上参与多肽链的合成二、核蛋白体循环二、核蛋白体循环        活化氨基酸缩合生成多肽链的过程在核蛋活化氨基酸缩合生成多肽链的过程在核蛋白体上进行活化氨基酸在核蛋白体上反复翻白体上进行活化氨基酸在核蛋白体上反复翻译译mRNA上的密码并缩合生成多肽链的反应过上的密码并缩合生成多肽链的反应过程，称为核蛋白体循环程，称为核蛋白体循环 核蛋白体循环过程可核蛋白体循环过程可分为起动、延长和终止三个阶段分为起动、延长和终止三个阶段，这三个阶段，这三个阶段在原核生物和真核生物类似，现以原核生物中在原核生物和真核生物类似，现以原核生物中的过程加以介绍。

的过程加以介绍 （一）起动阶段（一）起动阶段        在起动因子和在起动因子和GTP的参与下，小亚基先与的参与下，小亚基先与mRNA的起动部位结合，然后蛋氨酰的起动部位结合，然后蛋氨酰-tRNA通过通过其反密码与其反密码与mRNA上起始密码互补辨认而结合，上起始密码互补辨认而结合，最后大亚基与小亚基结合形成蛋白质生物合成的最后大亚基与小亚基结合形成蛋白质生物合成的起始复合体（见下页图）起始复合体（见下页图）  下图：蛋白质生物合成的起始阶段下图：蛋白质生物合成的起始阶段mRNA A U G 蛋白质生物合成的起始复合物小亚基起3、13′A C AmRNA5′3′小亚基蛋氨酰-tRNAGTP起25′大亚基GDP + Pi给位 A U G A C A小亚基蛋U A C蛋 A U G A C A5′3′小亚基受位蛋U A C（二）肽链延长阶段（二）肽链延长阶段            1．进位．进位  与与mRNA下一个密码相对应的氨基酰下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位此步骤需进入核蛋白体的受位此步骤需GTP，，Mg2+，，和和EF参与。

参与       2．转肽．转肽  在转肽酶的催化下，将给位上的在转肽酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰酰tRNA上，与其上，与其α-氨基缩合形成肽键此步骤需氨基缩合形成肽键此步骤需Mg2+，，K+给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA从核蛋白上脱落从核蛋白上脱落              3．移位．移位  核蛋白体向核蛋白体向mRNA的的3‘- 端滑动相当于端滑动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从受体移到给从受体移到给位此步骤需位此步骤需EF（（延长因子）、延长因子）、GTP和和Mg2+参与此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的氨基酰氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长（见下肽链不断延长（见下5页图） 下图：肽链合成的延伸阶段 1蛋白质生物合成的起始复合物给位 A U G A C A5′小亚基受位蛋U A C3′苏U G UGTPGDP+Pi延1①进位下图：肽链合成的延伸阶段 2给位蛋 A U G A C AG U UU A C5′mRNA苏U G UU G U受位3′Mg2+ K+②转肽下图：肽链合成的延伸阶段 3 GDP+PimRNA蛋 A U G A C AG U U给位U A C5′苏U G U受位3′U A CGTP延2③移位 A U G A C AG U UU G UU G U下图：肽链合成的延伸阶段 4给位 A U G A C AG U U5′mRNA蛋苏U G UU G U受位3′多次重复上述三个步骤缬缬C A AC A A下图：肽链合成的延伸阶段 5下图：肽链合成的延伸阶段 5mRNAU A A5′3′U A CA U G终止密码mRNAU A A5′3′A U GA U G终止密码 （三）肽链合成的终止阶段（三）肽链合成的终止阶段 核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。

1．识别 RF（终止因子）识别终止密码，进入核蛋白体的受位 2．水解 RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放 3．解离 通过水解GTP，使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基（见下3页图）下图：肽链合成的终止阶段 1mRNAU A A5′3′U A CA U GA U G终识别下图：肽链合成的终止阶段 2下图：肽链合成的终止阶段 2下图：肽链合成的终止阶段 2下图：肽链合成的终止阶段 2mRNAU A A5′3′A U G终多肽链水解mRNAU A A5′3′U A CA U G终多肽链水解mRNAU A A5′3′A U G终多肽链水解mRNAU A A5′3′A U GA U G终多肽链水解mRNA3′U A AU A CA U GA U G终A U G终U A AU A CmRNA小亚基大亚基肽链合成的终止阶段 3解离三、多肽链合成后的加工修饰三、多肽链合成后的加工修饰 （一）一级结构的加工修饰： 1．N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除 N端甲酰蛋氨酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。

2．氨基酸的修饰 由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等 3．二硫键的形成 由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S- 4．肽段的切除 由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除 甲酰蛋氨酸-肽 甲酸+蛋氨酸-肽甲酰化酶蛋氨酰-肽 蛋氨酸+肽蛋氨酸氨基肽酶     （二）高级结构的形成（二）高级结构的形成          1．构象的形成：多肽链合成后，通过卷曲、．构象的形成：多肽链合成后，通过卷曲、折叠折叠 形成特定的空形成特定的空 间构象       2．亚基的聚合．亚基的聚合       3．辅基的连接．辅基的连接    四、蛋白质生物合成的调节四、蛋白质生物合成的调节 人体的各种细胞都是从一个受精卵发育分化而来的 ，其遗传信息都来自受精卵固有的DNA为什么发育过程分化成不同的组织细胞呢？这是由于发育过程中DNA有不同的表达、合成不同的蛋白质、从而形成不同的组织细胞而且有些蛋白质是结构蛋白质，另一些是有生物活性的功能蛋白质。

即使同一组织内在不同发育阶段也会有不同的功能蛋白质例如，成人血红蛋白由两条α-链和两条β-链组成自然，不同细胞合成的不同蛋白质，例如胰岛β-细胞合成胰岛素而α-细胞合成胰高血糖素这说明在遗传信息指导下的蛋白质生物合成是受精卵调节和控制的即使已经合成的新生蛋白质，也要运送到特定的细胞部位而这种运送也是受控制的 蛋白质合成依赖于正确的遗传信息的转录，遗传信息的翻译和营养物质的合理供应现将转录水平和翻译水平的蛋白质合成的调节分别简述如下： （一）转录水平的调节 细胞内基因不是同时全处于活动状态，只是那些解除了组蛋白对DNA某个片断的封闭的部位才能表达，即进行复制和转录转录过程是受操纵子控制的操纵子指DNA分子中的一个片段，是转录单位它含有起动基因、操纵基因和结构基因，可作为转录的模版，指导mRNA的合成起动基因是RNA聚合酶与DNA结合并转录的部位操纵基因为控制RNA聚合酶向结构基因移动的部位当阻遏蛋白结合到操纵基因上时，RNA聚合酶的移动即被阻断，从而阻止转录的进行，间接影响蛋白质的合成 在操纵子前端有调节基因它含有合成阻遏蛋白的遗传信息，可作为模版转录出mRNA并指导阻遏蛋白的合成。

诱导物（某些代谢物或外源性化学物质）能特异地与阻遏蛋白结合，引导阻遏蛋白的变构，使之不能在与操纵基因结合，于是在起动基因上的RNA聚合酶即可移动到结构基因上，开始转录并合成mRNA,从而促进蛋白质合成（见下两页图）基因操纵子调节示意图1调节基因启动基因操纵基因结构基因转录翻译阻遏蛋白操纵子RNA聚合酶阻遏蛋白阻挡操纵基因，结构基因不起作用mRNA基因操纵子调节示意图2mRNA调节基因启动基因操纵基因结构基因诱导物-阻遏蛋白结合物操纵子RNA聚合酶诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白不起阻挡作用，结构基因发生作用调节基因启动基因操纵基因结构基因操纵子阻遏蛋白转录（二）翻译水平的调节 翻译水平的调节较为复杂，对其普遍规律也了解不多已发现兔网织红细胞在合成珠蛋白的过程中含有调节蛋白质合成的级联系统此系统可控制起始因子的活性细胞中有依赖cAMP的蛋白质激酶，它由两个调节亚基R和两个催化亚基C组成（R2C2）R2C2无活性，在cAMP的促进下， R2C2 转变为2R-cAMP和有活性的C2 C2使无活性的起始因子激酶磷酸化转变为活性的起始因之激酶，后者使起始因之磷酸化失活，从而抑制蛋白质的生物合成。

血红素能抑制这种依赖cAMP的蛋白激酶的活化，所以它可调节珠蛋白的合成（见下页图）下图：血红素对起动因子下图：血红素对起动因子-2的调节作用的调节作用 cAMP + R2C2 C2 + 2R-cAMP起动因子-2激酶 （无活性）起动因子-2激酶 （有活性）PATPADP起动因子-2起动因子-2P(有活性）（无活性）ATPADP无活性蛋白激酶活性蛋白激酶血红素－++五、蛋白质生物合成与医药学的关系五、蛋白质生物合成与医药学的关系          不论是由于基因表达上的误差，还是某不论是由于基因表达上的误差，还是某些物质对基因表达的干扰（影响转录），以些物质对基因表达的干扰（影响转录），以及对翻译过程的干扰或是营养素的缺乏，都及对翻译过程的干扰或是营养素的缺乏，都可导致蛋白质生物合成障碍，以致影响生命可导致蛋白质生物合成障碍，以致影响生命活动例如分子病、酶缺陷疾病、营养缺乏活动例如分子病、酶缺陷疾病、营养缺乏病等蛋白质生物合成的原理被广泛用于研病等蛋白质生物合成的原理被广泛用于研究抗生素、抗肿瘤药物以及很多重大的医学究抗生素、抗肿瘤药物以及很多重大的医学课题上。

课题上（一）分子病（一）分子病           分子病是指蛋白质分子一级结构的氨基酸组分子病是指蛋白质分子一级结构的氨基酸组成、序列与正常有所不同的遗传性疾病成、序列与正常有所不同的遗传性疾病是由于是由于DNA分子上某一结构基因核苷酸序列的异常，最分子上某一结构基因核苷酸序列的异常，最终造成蛋白质的异常终造成蛋白质的异常 例如镰刀形红细胞性贫血，例如镰刀形红细胞性贫血，，患者红细胞内的血红蛋白分子，患者红细胞内的血红蛋白分子ββ- -有异常改变有异常改变正常人血红蛋白正常人血红蛋白ββ- -链的第链的第6 6位是谷氨酸残基位是谷氨酸残基 ，但，但镰刀形红细胞性贫血患者血红蛋白镰刀形红细胞性贫血患者血红蛋白ββ- -的第的第6 6位却位却是缬氨酸残基引起是缬氨酸残基引起ββ- -链异常的原因是由于在链异常的原因是由于在DNADNA分子控制分子控制ββ- -链合成的基因上，正常人应有胸链合成的基因上，正常人应有胸腺嘧啶脱氧核苷酸占有的序列位置却被腺嘌呤脱腺嘧啶脱氧核苷酸占有的序列位置却被腺嘌呤脱氧核苷酸所占据（见下页图）氧核苷酸所占据（见下页图） 血红蛋白的这一变异，导致其功能发生明显血红蛋白的这一变异，导致其功能发生明显改变。

改变HbSHbS在氧分压低的情况下容易在红细胞中析在氧分压低的情况下容易在红细胞中析出，使红细胞变形并易于破裂（见出，使红细胞变形并易于破裂（见541541页图）下图：镰刀形红细胞性贫血病血红蛋白（下图：镰刀形红细胞性贫血病血红蛋白（H b -sH b -s））中遗传信息的异常中遗传信息的异常 DNA …TGT GGG CTT CTT TTT …mRNA …ACA CCC GAA GAA AAA …HbA 氨基端… 苏 脯 谷 谷 赖正常｛｛异常DNA …TGT GGG CAT CTT TTT …mRNA …ACA CCC GUA GAA AAA …HbS 氨基端…苏 脯 缬 谷 赖HbA:正常成人血红蛋白；HbS:镰刀形红细胞性贫血病人的血红蛋白下图:镰刀形红细胞性贫血病（二）抗生素对蛋白质合成的影响（二）抗生素对蛋白质合成的影响          多种抗生素作用于合成过程中的复制多种抗生素作用于合成过程中的复制、、转转录录、、翻译各个环节。

通过阻断致病微生物的蛋翻译各个环节通过阻断致病微生物的蛋白质合成而发挥作用如氯霉素和链霉素能与白质合成而发挥作用如氯霉素和链霉素能与细菌的核蛋白体结合，四环素族抗生素能与核细菌的核蛋白体结合，四环素族抗生素能与核蛋白小亚基结合，抑制氨基酰蛋白小亚基结合，抑制氨基酰-tRNA进位以上三种抗生素都有干扰蛋白质合成的作用，但上三种抗生素都有干扰蛋白质合成的作用，但氯霉素和链霉素不易与哺乳类动物细胞的核蛋氯霉素和链霉素不易与哺乳类动物细胞的核蛋白体结合，所以一般剂量不影响人体蛋白质的白体结合，所以一般剂量不影响人体蛋白质的合成用于抗肿瘤治疗的争光霉素合成用于抗肿瘤治疗的争光霉素、丝裂、丝裂霉素霉素、、放射菌素等有抑制放射菌素等有抑制DNA模板从而影响转录的作模板从而影响转录的作用复习题复习题 1.简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用 2.试述蛋白质生物合成过程 3.图示并说明基因操纵子调节作用 4.何谓分子病？举例说明 本章完 2005年3月12日初稿 2005年4月21日整理 2005年5月13日定稿 。