毕赤酵母表达知识.docx

很好，需要好好研究一下 原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a. 配制 500XBI0TIN stock solution （0.02%）有这么 3 种方案：1、 懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、 急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、 水浴加热，温度不能高于50度D —生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH 在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用天然培养基中一般可以不单 独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度 发酵还是必须要添加的b. 有几个比较迷惑的问题请教大家：（很典型的小问题）1、 制感受态细胞，0D多少比较好？pyrimidi ne战友的方法：取1mlGS115过夜培养物（0D约6-10）分装到1.5ml EP 管中说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、 关于高效转化法，文献说用（LiAc）,而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母 用（LiAc）没用，要用LiCILithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、 YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？ 我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭然后把 配好的溶液用注射器一点点推进去4、 葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会 该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、 电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400 都是从园里看到的！电击参数：1.5KV, 25uF，200欧姆（不是400）6、 电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？ 如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的invitrogen手册上可以灭菌的 glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌 颜色很深的话，基本不能使用了想请教下关于菌种保存的方法 我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌 量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油 菌的保存方法我一般吸取300ul的菌液到灭菌的EP管然后加等体积的甘油，混匀.防于一20度.保存长的话最好放一80度冰箱一般0D是2-6,过夜菌在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也 有点差异,如下：每次转化前，均用多种酶切，Blgll/sall/sacl同时切，然后转化时，用 GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我 用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G,长出菌落后，即 进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用丫PD表达的，一般 48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到 目的带后再做PCR，测序。

我已用这儿方法做了好几个基因出来关于酵母表达时BMMY的PH值我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一 些但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最 好要远离目标蛋白的pl像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能 和工艺页有关系而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳 目标带大量减少，杂带大量增多求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高 招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降 解你可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生 长pH值比较广，4〜7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物； 3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了实在没办法， 只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases. The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.如何优化密码子来提高蛋白表达量，具体考虑哪些因素（肯定不是单纯的全部置 换为使用频率高的密码子吧)看有些文献优化后的密码子有些都是使用频率不高 的，实在很困惑.有没有做过这方面的，急切的想得到你的指导，收取一定的费 用也可以。

谢谢了，我在上海密码子改造对提高表达量只有有限的作用影响外源蛋白在Pichia中表达水平的限速步骤(rate-limiting factors)很多 涉及到转录，翻译，蛋白在ER和Golgi的合成和折叠，以及分泌信号肽定位和 切割，蛋白修饰等很多方面(H. Hohenblum, Biotechnologyand Bioenginering, 2004, 85:367-374) 关键是根据你要表达的蛋白性质以及DNA序列特性来推测(！)哪个步骤是关键 的限速步骤实际上，很多分泌表达的蛋白，蛋白在ER中合成和折叠以及信号肽的切割是关 键步骤现象是很多错误折叠的蛋白在胞内聚集和降解密码子作为限速步骤很多时候体现在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素转录 提前终止，这方面文献在NCBI上有一些我用Pichia酵母分泌表达两个不同的蛋白，结果WesternBlot的结果显示，两 个蛋白均比理论分子量少了 20k左右难道都是被发酵液中的蛋白酶降解了？大 家碰到过这样的情况吗？如果是少了 20K左右，肯定要考虑酶解的可能了•你的目的蛋白一级序列是否有 Pichia酵母的Kex2酶降解位点.我现在做的蛋白就有这种情况，但是是降解产物 和目的蛋白共存,有的蛋白幸免遇难用Bglll、Sall、SacI酶切 的区别是什么？我是想做蛋白表达，用BglII后转化行么？它们三个是不是哪个可以用了？BglII好像能把质粒切成两段，与其它两种线性化方法比较，较易生成muts型 的转化子，当然比例也是少。

Sall、SacI酶切基本只能产生mut+型的转化子，我看文献介绍，后者的转化效 率比前者要高我用前者线性化的，感受态也是用常规方法，没有DTT LiCl什么的，板子也是 长得满满的哪位有毕赤酵母上罐的一些无机培养基配方能提供参考！谢谢！毕赤酵母基因组DNA PCR怎么也p不出来，质粒和线性化后的质粒都能P出来，但是电转化进入毕赤酵母GS115后怎么也p不出来，不知怎么了？以前做的都是小菜一碟呀， 那位战友有这方面的经验啊？是不菌株有问题啊？恳求指点一下！ 非常感谢！电转化后涂在MD平板上的么？ 应该大部分都是阳性克隆，可能是你提基因组的方法有问题， 以前有战友介绍过菌落PCR的方法，我刚试过，效果非常非常好2.2kb的片段非常清楚退火温度我用的56度1min, 72度2min, 35个循环挑取单菌落均匀涂抹于管底，开盖在微波炉中档加热1min, -80°C5min,再加热 一次，然后加入20ul水，取1ul作为PCR模板他本来说离心取上清为模板，我就直接取的非常非常好用，一般的方法提基因组，比如煮冻煮法等，很难P出2.2kb的A0X1基因 而这个方法就能，还非常明显你翻一下前两页吧，我还把自己的图贴出来了。

选5 "aox和3' aox这两个引物，这样还能判断你的转化子是mut+或muts型的 跑出两条来说明是mut+，其中一条2.2kb的就是aoxl基因这里不涉及aox2，建议你去invitrogen网站下一本multicopy pichia expressi on manual, 看一遍就很清楚了MD平板上的阳性克隆应该比例很大的，我觉得3个就至少有一个是万事都没那么觉对的，在整合时，可能仅His4基因整合入了酵母基因组，所以 也能生长，但无目的基因请教几个问题1. 鉴定重组时候，我煮冻煮方法获取酵母基因组作为模板，用目的基因的引物 进行扩增，结果有些产物很强，有些很弱，为什么？2. 是否存在这样情况，线性化载体进入酵母内，没有进入核内进行重组，或者 进入核内，仅仅黏附在酵母基因组上，没有发生重组呢？如果有这个情况，该如何区别？3. 用烧瓶摇菌的转速对表达有什么影响，听说过高转速使酵母总处于分裂增殖， 而表达低？4. 大家大规模发酵的步骤是怎么样的，能提供一个方案吗？关于PCR的问题，我觉得你的模板差异大吗？我做很多次PCR鉴定，发觉模板量 的差别对PCR的结果会有非常大的影响不过我做的PCR鉴定，基本上都是用 AOX1引物P的，倒是没用过目的基因引物。

摇瓶的问题我也说不出来，因为我到目前为止都没做出分泌性表达来，汗啊……（都在胞内了）速度我都是按照Protocol 上的推荐速度摇的，一般都是250rpm 以上我做的时候使用蜗牛酶消化0.5h,然后沸水浴15min, 12000g离心3min,取1ul做模板即可再问个有关GAP质粒表达的问题小量摇瓶表达的时候需要保证氧通量而使用双层纱布包住瓶口吗？还是直接用 牛皮纸包住就行了？一般说来,小瓶发酵的时候只需要用牛皮纸包住瓶口就可以了,摇床的速度不要 过快,那样会使得通气量不够,小瓶发酵时由于不添加消泡剂所以应该避免摇速 过快而引起得泡沫泡沫得产生直接影响到通气的效果我们在做大规模发酵时才用纱布将发酵罐的饿通气口都包住,小瓶发酵,那么做 得话,可能会导致污染,因为酵母是长得比较慢的这个想法可以阿盐浓度对表达的影响我想有个问题,缓冲液是起缓冲作用的,浓度低了影响缓冲效果,浓度高了抑制菌生长？可以做不同pH的比较试验，再加上其他的因素。