单克隆抗体的制备课件讲义资料.ppt

单克隆抗体的制备广州医学院第一附属医院检验科廖伟娇一、单克隆抗体概念： 每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选择杂交瘤细胞阳性孔克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清4.培养基的选择：HAT培养基含有三种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.细胞的DNA合成一般有两条途径：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与反应B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA6. HAT培养基的选择原理： 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。

B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活57d，且功能下降) 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活7. 克隆化并扩大培养(单细胞培养称为克隆化)：有限稀释法:将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔(36%的孔为1个细胞/孔)，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养软琼脂平板法：下饲养/上融合C,分层培养后用法细胞分选仪法：流式细胞仪分选8. 单克隆抗体的制备、纯化：A 体外细胞株扩大培养，取上清液提纯B 接种小鼠腹腔，取腹水提纯C 纯化按抗体纯化步骤进行9. 细胞株冻存和复苏：加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜(DMSO)冻存液后液氮(-196 )保存原则是：慢冻(逐步降温，以每分钟降1为宜)，快融(立即浸入3740 水浴)10.注意事项： 用降植烷(pristane)等油类制剂，反复注入BALB/C小鼠腹强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞这种细胞在适宜培养条件下，具有无限繁殖能力，选择本身不会产生Ig (SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。

选择缺乏HGPRT或TK的细胞： A 采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)选育出缺乏HGPRT的细胞(因为缺乏HGPRT+细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+ 细胞才能存活），培养过程中有个别细胞出现返祖现象，故应定期用1520ug/ml的 8-AG处理细胞B 或利用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BudR)诱发缺乏TK的细胞一般选育缺乏TK的细胞较困难采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖当加入一定量的其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁殖，这种加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞/腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞三、单克隆抗体的应用：1.诊断(检测)试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等2.治疗：A 移植物受者使用T细胞的McAb，可预防急性排斥反应B 供体骨髓在体外经T细胞的McAb处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应C AIDS治疗D 肿瘤介入治疗：细胞毒剂(药物)与抗肿瘤抗原的McAb结合后，利用McAb的导向作用，将细胞毒剂(药物)定位于肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。