产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化研究.doc

产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高 密度发酵及产物的分离纯化研宄翟立邈奎国丽冷艳李师翁鹿盥服陈拓刘光诱 兰州交通大学化学与生物工程学院 微生物资源与工程重点实验室/中国科学院西北生态 环境资源研宄院沙漠与沙漠化重点实验室以本实验室构建的产抗菌肽PST的重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌作为出发菌 株，在摇瓶培养的基础上，建立Y 100 L发酵罐中高密度发酵的工艺及产物分离 纯化方法研宄了不同培养基、菌体密度、诱导物及其添加方式等对产物的影响 结果表明，用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导, 乳糖添加量为5 kg，补料流加速度为lL/h,诱导25h,菌体细胞湿重达280 g/L， 发酵液中蛋白产量达27. 8 mg/L,抗菌肽PST效价达到2. 36X 109 U/L采用多 种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化，结果表明，阴离子交换 色谱纯化效率最高，纯化后蛋白效价为8.83X 109U/L，其次为丙酮沉淀、超滤、 硫酸铵分级沉淀，纯化后蛋白效价依次为6 . 35 X 109、4. 56X10% 3 . 28X109U/L关键词：抗菌肽PSI;乳酸克鲁维酵母;基因工程菌;高密度发酵;分离纯化;李师翁，，教授，: lishweng@mail. lzjtu. com。

2017-09-26基金：国家自然科学基金(31400437):国家自然科学基金(31560121)High cell density fermentation of recombinant Kluyveromyces Lactisproducing antimicrobial peptide PSI and PSI purificationZHAI Li-xiang LI Guo-li LENGYan LIShi-weng CHENXi-ming CHEN Tuo LIUGuang-xiuSchool of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University; Key Laboratory of Extreme Environmental Microbial Resources andEngineering， Northwest Institute ofEco—Environment and Resource，Chinese Academy ofSciences;Abstract：This paper reports the high density fermentation technology for the production of antimicrobial peptide PST in a 100 L fermentor using a recombinant Kluyveromyces lactis strain. The effects of mediums, cell density, lactose, as well as the fed-batch models of inducer lactose into the fermentor, on the production of PSI were investigated. Results obtained show that the inducer lactose should be added when the cell density was at 190 g/L during the fermentation using BSM medium, the addition of lactose was 5 kg with feeding velocity of 1 L/h. When the induction culture time was 25 h, the cell wet weight, the protein yield, and the titer of PSI reached to 280 g/L, 27.8 mg/L, and 2. 36X 109 U/L, respectively. The separation and purification of the PSI in the fermentation broth were also investigated. The purification efficiency of anion exchange chromatography, ultrafiltration, precipitation of ammonium sulphate or acetone were 8. 83 X 109 U/L, 6. 35X 10J U/L, 4. 56 X 109 U/L, and 3. 28X 109 U/L, respectively, indicating that the most efficient technique for the purification of PST was anion exchange chromatography.Keyword：Antimicrobial peptide PSI; Recombinant bacteria; Kluyveromyces lactis; high cell density cultivation; purification;Received： 2017-09-26 乳酸克俜维酵母(Kluyveromyces lactis, K. lactis)是一种能高效表达外源蛋 白的酵母表达系统，作为美国FDA认证的食品安全级酵母U1，具有遗传稳定、 蛋白可翻译后加工、产物可分泌到胞外、可高密度发酵II发酵过程无产气现象， 不会发生爆罐、发酵过程中所需的诱导剂是乳糖或半乳糖，相对甲醇诱导更安 全、表达产物可直接应用于食品及饲料工业中等优点m。

应用非常广泛，己经 有数百种外源蛋白在该系统中获得表达抗菌肽PSI是植物天冬氨酸蛋白酶的前体，其典型特征是分子内部有一个约由 wo个氨基酸残基构成的结构域，被称为植物特异插入片段m，对植物病原真 菌Verticilliumdahlia具有较强的抗性，其作用机制是通过与磷脂膜泡相互作 用，在一定pH下或考依附于脂质而诱发细胞内容物的裂解，从而杀死生物病原 体、抑制真菌孢子的形成 高密度发酵是提高基因工程菌外源蛋白表达量的有效策略迄今为止，已有数千 种蛋白通过高密度发酵得以大量表达，如人的C型溶菌酶LYZL6表达量高达 331mg/LX5l，植酸酶酶活达1.34X10U/m LM，来自兔出血病病毒的衣壳蛋白 表达量达16 mg/L[7],麦角固醇表达量达1.5 g/L[8]等但是，由于重组菌本 身的局限性，如启动子特性、密码子使用频率或基因拷贝数等，或者是由于发酵 工艺的不同，外源蛋白表达量差异很大目前，针对乳酸克鲁维酵母高密度发酵， 业界已经建立了技术相对成熟的补料分批发酵和连续发酵两种发酵方式m,在 实验室基础上，主要研宂补料分批发酵工艺的影响和调控发酵产物的分离、提取和纯化是发酵工业中重耍的步骤，分离纯化技术的落后， 会严重阻碍微生物工程产品的工业化进程，使实验室成果无法转化为生产力。

本 研宄应用重组乳酸克鲁维酵母表达抗菌肽PSI，优化了发酵罐发酵工艺，并对 发酵液中抗菌肽PST的分离纯化方法进行了比较和分析，采用SDS-PAGR检测其 纯化效果为发酵法制备抗菌肽PSI过程中的分离纯化工艺提供理论依据1材料与方法1.1材料重组抗菌肽PST乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21由本实验室构建并保存[11]主要仪器：10L-100L双联发酵罐:江苏镇江东方生物工程设备技术有限责任公司; 小型垂直蛋白电泳仪:美国Bio-Rad公司;Q-Sepharose:Amersham公司;UFC超滤 管:Millipore公司；台式高速冷冻离心机:利康发展有限公司；化学试剂均为国 产分析纯微量盐 PTM (1L) : Cu S04 6g、Na I 0. 08g、Mn S04 3 g、Na2Mo 0,0. 2g、H3B03 0. 02g、 Co Cl2 0. 5g、Zn Cl2 20g、Fe S04 65g、Biotin 0. 25g、H2S04 5m L,过墟除菌YDFM 培养基(IL) : (NHi) 2S0410 g、葡萄糖 30 g、精氨酸 1 mmol、赖氨酸 1 mmol、 KH2P04 11. 83g、K2HP04 2. 29 g、Mg S04 1 g、Ca Cl2 0. 33 g、Na Cl 1 g、KC1 1 g、 PTM 4.35m L。

YDFMY培养基(IL) : (NHJ 2S0, 10 g、葡萄糖30 g、精氨酸1 mmol、赖氨酸1 mmol、KILP0,11.83 g> KJ IPO, 2. 29 g> Mg SO., 1 g、Ca Cl2 0. 33 g、Na Cl 1 g、 KC1 1 g> PTM 4. 35 m L,酵母提取物10g,胰蛋白胨20 gBSM 培养基(IL) :85%H 3P0i0. 387 mol/L、Ca S0,0. 93 g、K2S0418. 2 g、葡萄糖 30 g> Mg SO., 14. 9g、KOH 4. 13 g、PTM 4. 35m L,氨水调 p H 至 5. 0BSMY 培养基(IL) :85%H3P04 0.387 mol/L、Ca S04 0 . 93 g、K2SO4 18. 2 g、葡萄 糖 30 g、Mg S0J4. 9 g、K01I 4. 13 g、PTM 4. 35 m L,酵母提取物 10g,胰蛋白 胨20 g,氨水调p H至5.0补料培养基:葡萄糖储液500g/L和乳糖储液200g/L分别于灭菌锅中121C灭菌 30min,冷却后加入 4. 35 m L/L PTM。

PBS 缓冲液(1L,含 0.2 g 叠氮钠)：Na Cl 8 g、KC1 0.2 g、Na2HP04 1.4 g、 KH2P0: 0. 24 g、Na N30. 2g,调 p H 至 7. 4，过滤除菌1.2实验方法1.2.1重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21高密度发首先对10L种子罐和100L发酵罐分别进行空消，然后在种子罐装入4L YDFM培 养基，发酵罐装入40LBSM培养基,于121C灭菌30min,待培养基冷却到30C 后，将提前摇好的1L种子液接入种子罐，温度30C，搅拌速度500 rpm/min， 通气量7.5m3/h，生长24h后接入己灭菌的100L发酵罐中，温度30C，p H6. 0, 搅拌速度500rpm/min,通气量75m3 /h，生长24h后开始流加葡萄糖使菌体密度 增加，当菌体湿重达到190g/L时，开始流加乳糖诱导诱导25h后收获产品，检 测抑菌活性并计算生物效价及蛋白产量1.2.2抗菌肽生物效价及产量检测发酵液经12 000 rpm离心2 min，0.22um滤膜过滤后，用打孔法做抑菌实验，每 孔加入75 PL的抗菌肽测试样品溶液，每个样品3个重复30C培养2天后，观 察抑菌圈大小并测量抑菌圈直径，根据公式计算抗菌肽的生物效价。

式中：y抗菌圈抑菌直径（mm）,取平均值;4为孔穴直径（mm） ;2. 1为抗菌肽浓 度与抑菌圈直径的比值常数蛋白产量(mg/ml) = (1.45XA280-0. 74XA260) X稀释倍数式中:A28Q和A26分别代表波长在280™和260™处的吸光值1.2.3响应面法优化发酵条件根据单因素试验结果，选取诱导前时间间隔、乳糖流加量以及乳糖流加速度3 个因素作试验因素，分别用A。