反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究.docx

反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究耐药结核病尤其是耐多药结核病 (multi-drug resistanttuberculosis,MDR-TB,) 及广泛耐药结核病 (extensively drug resistanttuberculosis,XDR-TB,) 的出现和流行成为了全球重点关注的公共卫生问题及社会问题长期以来 , 以细菌培养为基础的传统药敏试验被视为金标准广泛应用于临床 , 但其耗时长 , 结核病患者在初期得不到及时有效的治疗而延误病情 新兴的分子生物学方法在部分一线抗结核药物中已经取得了良好的检测效果 , 几乎可以与表型药敏试验相媲美 , 但它们需要特殊的仪器试剂 , 且在二线药物检测中应用较少而反向斑点杂交 (Reverse dot blot hybridization,RDBH) 是一种基于基因扩增上的分子杂交技术 , 具有快速、简便、高效、直观等特点本研究旨在建立一种能同时检测结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB) 对四种一线和四种二线抗结核药物耐药性的 RDBHfc术，以实现耐药结核病的全面快速检测，为有效防治耐药结核病提供新的技术手段。

分别针对结核分枝杆菌八种药物 , 包括四种一线抗结核药抗结核药异烟肼 (Isoniazid,INH) 、利福平(Rifampicin,RIF) 、链霉素 (Streptomycin,SM) 、乙胺丁醇 (Ethambutol,EMB) 和四种二线抗结核药氧氟沙星 (Ofloxacin,OFX) 、 卡那霉素 (Kanamycin,KAN) 、 阿米卡星 (Amikacin,AMK) 、 卷曲霉素 (Capreomycin,CPM), 主要耐药相关基因及常见的突变位点 , 设计合成 46 条氨基标记的特异性寡核苷酸探针通过小样本试验优化RDBHft术条件,建立RDBHft术,并对326株和170株MTB临床分离株分别进行一线、二线抗结核药物耐药性检测，采用比例法药敏试 验和dnaM序结果作对照，初步评价该技术的检测效能经过实验条件的反复优 化，最终确定了探针序列、探针终浓度为 0.5?M、杂交盐离子浓度为5XSSPE/0.1%SDS最适杂交温度60C、洗膜温度50C、POD-TM的显色体系同时应用比例法药敏试验、DNAW序和RDBHfe术分别对326株和170株MTB临床分离株进行了 INH、RIF、SM EM训种一线抗2核药物和 OFX KAN AMK CPM 四种二线抗结核药物的耐药性检测，以比例法作参照，RDBH佥测INH、RIF、SMEMB OFX KAN AMKF口 CPM勺敏感度分别为 84.5%(185/219)、86.5%(166/192)、72.3%(120/166) 、 55.4%(51/92) 、 62.8%(59/94) 、 56.0%(14/25) 、 61.5%(8/13)和 45.0%(9/20); 特异度分别为 95.3%(102/107) 、 95.5%(128/134) 、91.3%(146/160) 、 82.1%(192/234) 、 100.0%(76/76) 、 100.0%(145/145) 、98.7%(155/157) 和 99.3%(149/150);Kappa 值分别为 0.75 、 0.80 、 0.63 、 0.37 、0.60、0.68、0.57和0.37;以DNAW序为为参照，八种药物耐药性检出率分别为97.9%(189/193) 、 97.7%(171/175) 、 97.8%(134/137) 、 82.0%(91/111) 和93.7%(59/63) 、 92.9%(13/14) 、 90.0%(9/10) 、 90.0%(9/10); 特异度分别为99.2%(132/133) 、 97.4%(148/152) 、 100.0%(189/189) 、 99.1%(213/215) 和100.0%(107/107) 、 99.4%(155/156) 、 99.4%(159/160) 、 99.4%(159/160);Kappa值分别为 0.97 、 0.96、 0.98 、 0.84 、 0.95、 0.92 、 0.89 和 0.89 。

本研究建立的反向斑点杂交技术对结核分枝杆菌八种药物的耐药性具有良好检测效果 , 为开发快速检测耐药性试剂盒奠定基础 , 在结核病一、 二线八种抗结核药物耐药性检测和监测上具有良好的应用前景 。