蛋白质浓度的紫外测定.docx

蛋白质浓度的紫外测定1实验目的(1) 了解蛋白中20个常见氨基酸的结构(2) 掌握紫外分光光度法测定蛋白质的原理及应用2实验原理蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香环结构对紫外光有吸收 作用色氨酸的吸收最强，但由于一般蛋白质中酪氨酸的含量比色氨酸高许多， 因此这一吸收可认为主要是由酪氨酸提供的其最大值在280nm附近，不同的 蛋白质吸收波长略有差别在无其他干扰物质存在的条件下，280nm的吸光度即 可作蛋白质的测定用，但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性 氨基酸残基含量的不同而有差异1 mg/m 1浓度的不同蛋白质的吸光度值在 0.5〜2.5之间，因此测定未知浓度蛋白需用同种蛋白质对照结果才可靠测量方法和计算公式：a) 对于不含核酸污染的蛋白溶液(如果样品光吸收值大于2.0,应将样品稀 释至光吸收值小于2.0)：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的 光吸收值，蛋白浓度与吸光度值成正比关系b) 对于存在核酸污染(A280/A260<0.6)蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白 对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光 吸收值，按照以下经验公式计算：蛋白浓度(mg/m1)= (1.55 X A280) - (0.76 X A260) (1) 蛋白浓度(mg/m1)= A205 三(27 +A280/A205) (2)将280nm的吸光度与260nm的吸光度各乘以系数相减求得接近的蛋白质浓 度。

A280与A260分别代表光径为1cm时样品在280nm和260nm的吸光度值本实验中使用的牛血清白蛋白样品纯度高，可忽略核酸等其他生物样品对紫 外吸收的影响，可直接做吸光度值与蛋白浓度的标准工作曲线紫外线吸收适用于蛋白质浓度为0.2~0.5mg/m1的样品的测定由于玻璃器皿会吸收紫外线，实验中需用石英池做容器3仪器和试剂⑴仪器石英比色池一个，移液器(配枪头)，紫外/可见分光光度计Varian 50 ProbeUV-Visible Spectrophotometer(2)药品牛血清白蛋白(biotech Grade)溶液以0.9%NaCl作溶剂配制，浓度为 lmg/ml, 0.9% NaCl 溶液4实验步骤(1) 在一组干的样品管中，将1mg/mL浓度的牛血清白蛋白用0.9%NaCl分别 稀释为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL体积均为 4mL2) 用紫外可见分光光度计分别测定每一浓度的白蛋白溶液的 A280值，以 0.9%NaCl作为空白调基线，记录所得读数，做标准工作曲线，并检查计算所得 结果是否与实际浓度相符3) 取未知浓度待测蛋白溶液，测定A280值，根据标准工作曲线计算待测液浓 度。

5实验数据记录及处理(1)根据实验记录的数据做出各浓度样品的吸收曲线如下：图一各浓度样品的吸收曲线（2）标准工作曲线根据记录的数据，发现各个吸收都是在波长277.94772nm处有最大吸光度，记录 各浓度溶液该处吸光度，做出标准工作曲线如图2：c / （ mg/mL）Linear Regression for DATA1_B:Y = A + B * XA-0.011310.00153B0.669540.00462RSD NP0.99993 0.00146 5 <0.0001Parameter Value Error图2标准工作曲线（左）及其线性拟合数据（右）（3）待测溶液浓度测定根据待测溶液吸光度读取数据A277=0.15931，代入图2的拟合关系中，可以得到待测液 的浓度：c=0.25 mg/mL6结果分析从标准工作曲线的拟合度来看，达到了 0.9993说明实际浓度与所得结果较为 符合，实验较为准确实验中还需要注意以下事项：（1） 空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊如有浑浊，应预先过滤， 并弃去初滤液2） 测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采 用1cm的石英吸收池。

3） 在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸 收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长 ±2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收 度最大的波长作为测定波长4） 由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减 去空白读数，再计算含量7实验讨论(1)紫外吸收法测定蛋白质浓度有何优缺点？受哪些因素影响和限制?优点缺点限制因素灵敏度高易产生干扰(如核酸)温度廉价测定浓度不能过大浓度测定快速便捷标准曲线仍有偏差酸碱性测定干扰物质少对蛋白质纯度要求较咼人为操作因素(2)紫外吸收法还可以用来做蛋白质哪些方面的研究？答：在质量监督方面可以用来检测肉类中蛋白质含量是否达标，文献信息如下:文献名称紫外吸收光谱法测定猪肉中蛋白质的含量作者张墨央；程瑞庆；摘要用紫外吸收光谱测定法测定了猪肉中蛋白质的含量，与凯氏定氨法对照， 一者无显著性差异，前者准确度较高，重现性好，简单方便。