怎样选育一株谷氨酸高产苗.ppt

怎样选育一株谷氨酸高产苗• 设计思路• 操作步骤• 应用紫外线诱变筛选耐高糖谷氨酸高产菌 株原理• 谷氨酸产生菌Brevibacterium tianjinese S9114是生物素缺陷型菌株，耐高糖菌种的 选育对发酵工艺上提高发酵培养基初糖浓 度具有积极意义菌种经过紫外线诱变处 理后，利用茚三酮的高糖选择性平板培养 ，耐高糖，产酸的菌株不但能够在平板上 长成菌落，而且菌落周围呈红色因此， 根据平板上菌落生长情况可以得到耐高糖 产酸的突变株，再经过摇瓶初筛,复筛可获 得耐高糖，高产的突变株操作步骤• （1）菌悬液制备 • 用接种环取一环经斜面活化的菌于50mL/500mL 三角瓶的增殖培养基中，置于振荡培养箱，32 C、96r/min培养8h取培养液于3500r/min离心 20min,弃去上清夜，用无菌生理盐水离心洗涤菌 体两次，然后，在装有玻璃珠的无菌三角瓶中， 以适量无菌生理盐水与菌体混合，充分振荡，制 成菌悬液，用显微镜直接计数，调节菌体浓度为 108个/mL.•(2)诱变处理 •预热紫外灯、加菌悬液、紫外灯照射•1）预热紫外灯：诱变箱的紫外灯为15W，照射距离为30cm,照射前 紫外灯预热20min,使紫外线强度稳定。

•2）加菌悬液：取5套装有磁力搅拌棒的无菌培养皿（ ɸ90mm),分别 标记 40s、60s、80s、100s、120s，并在每个培养皿中加入上述菌 悬液10mL•3）.紫外线照射：将上述培养皿置于磁力搅拌器上，开启开关使菌悬 液旋转，打开皿盖，分别照射40s、60s、80s、100s、120s照射后 ，盖上皿盖，取出放在红灯下• 3.稀释菌液及涂布选择性平板 • 将未经照射的菌悬液和上述照射的菌悬液用生理 盐水以10倍稀释法进行稀释，一般稀释成10-1~10 -6，分别取10-4、10-5、10-6，的菌液各0.1mL涂布不同葡萄糖浓度的平板对于每个稀释度以及 每个葡萄糖浓度选择性培养基，重复3个平板（用 无菌涂布棒涂布均匀，并于每个平板背面标明处 理时间、稀释度以及培养基的葡萄糖浓度）• 4.培养 • 将涂布好的平板用黑纸包好，倒置，于32 C培养48h• 5.菌落计数、计算致死 率以及绘制致死率曲 线 • 将培养好的平板取出 进行菌落计数根据 葡萄糖浓度为140g/L 的平板上的菌落数， 计算出紫外线处理的 致死率，计算公式如 下： • 致死率=• 6.观察诱变效应及挑取菌落 • 目前，一般倾向于选择致死率为70%~80% 的诱变剂量。

因此，首先从众多平板中选 出致死率为70%~80%的平板，再从中挑选 有菌落切葡萄糖浓度最高的平板观察菌 落周围颜色，选取30个左右红色较深、菌 落直径较大的菌落，移接到斜面上于32C 培养24h,作为摇瓶初筛、复筛使用• 7摇瓶产酸筛选 包括初筛和复筛 • 1）初筛：对照斜面及上述挑取菌株的斜面 培养后，分别用接种环取1环接于装有 50mL摇瓶发酵培养基德500mL三角瓶中， 一个菌株接1瓶置于振荡培养床，32C 、96r/min培养36h培养过程中，在无菌 操作条件下，定时检测pH，当pH降低至 6.8~7.0时，加入适量无菌尿素溶液应参 照谷氨酸生产工艺，以筛少量多次为原则• 进行添加尿素溶液发酵结束，检测发酵 液中谷氨酸含量（参照谷氨酸测定方法） ，确定产酸较高的5株菌株，做为复筛使用 • 2）.复筛：取培养好的对照斜面及上述5株 菌株的斜面，分别用接种环取1环接于装有 20mL摇瓶种子培养基的250mL三角瓶中， 一个菌株接1瓶，置于振荡培养床，32C 、96r/min培养10h然后，以5%的接种量 ，• 将种子培养液接于装有47.5mL摇瓶发酵培 养基的500mL三角瓶中，1个菌株接33瓶。

培养过程中参照谷氨酸生产工艺，采用变 速调温进行控制培养条件，并定时检查pH ，当pH降至6.8~7.0时，加入适量无菌尿素 溶液发酵结束，检查发酵液中谷氨酸含 量，筛选出产酸最高的1株菌株，作为生产 的菌株。