细胞凋亡检测方法.docx

细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡概念：细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用； 它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关，近年来一直是 生物医学领域各专业的研究热点选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键二、细胞凋亡的检测方法：1.磷酯酰丝氨酸（PS）外翻法（Annexin V法）在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸（PS）从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中荧光基团或荧 光蛋白标记的膜联蛋白V可与暴露在质膜外侧的PS结合，用于识别凋亡细胞碘化丙啶（propidine iodide, PI） 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细 胞核红染因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来应用实例：以 FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit为例子图1.使用10 mM喜树碱处理Jurkat细胞4小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做 阴性对照（左图）。

使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit对以上两组细胞进行相应的实验处理，流 式细胞仪进行观察2. Caspase-3活性的检测：半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件其中caspase-3的激 活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用Caspase-3正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞浆中， 在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa）和两个小亚基（12KDa）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡荧光法检测Caspase-3活性：Caspase-3 Z-DEVD-R110 Assay Kit是以 Z-DEVD-R110 为酶的特异性底物的其中，R11O 与短肽 DEVD 通过两个酰胺键共价相连由于DEVE的存在，抑制了 R11O的荧光活性在Caspase 3催化下,Z-DEVD-R110 经过两步逐渐打开共价键，释放出能够发射强烈荧光的R110通过检测R110的荧光变化来判断caspase-3 的活性Caspase substrate R110 monopeptide R110应用实例：以 Caspase-3/7 Z-DEVD-R110 Assay Kit 为例图 2. Detection of apoptosis activity in Jurkat cells using the Assay Kit. Cells were either treated with 10 gM camptothecin for four hours at 37°C to induce apoptosis (induced) or left untreated (control). Both induced and control cells were then harvested, lysed and assayed as described in the kit protocol活细胞caspase活性检测：LIVE Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Kit是一种简单的、免洗的，巳经进行优化测试的细胞凋亡检 测试剂盒，可以对微孔板中的活细胞进行实时监测，并能实时检测活细胞、凋亡细胞的荧光强度。

这种具 有膜亲和型的检测试剂盒是由一个4氨基的短肽DEVD和一种核酸结合染料凋亡发生时,Caspase孑7蛋白 被激活，从而剪切Caspase孑7识别序列DEVD剪切底物后，游离的核酸染料与DNA结合，从而发出亮绿 色荧光信号使用范围：使用于活细胞、固定细胞的细胞成像分析检测平台：荧光显微镜；荧光酶标仪3.线粒体膜电位的检测线粒体膜电位AVm是一个体现细胞健康水平的线粒体功能性参数线粒体膜电位在细胞凋亡发生时， 会受到干扰破坏这种膜电位变化可以通过荧光探针JC-1来检测在健康细胞中，线粒体膜电位水平高，JC-1进入细胞后容易粒体中富集成为多聚体，呈现红色荧光而在凋亡或疾病细胞中，线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式出现，发出绿色荧光利用JC-1探针荧光信号的变化来检测凋亡细胞中线粒体膜电 位的变化是快速简单有效的检测方法JC-1比DiOC6(3)以及罗丹明123更敏感和稳定JC-1线粒体膜电位检测试剂盒提供线粒体检测所需的必需试剂，可以用来检测细胞的线粒体完整性分 析应用实例：JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit 为例io1 io2 io3 必1 greenoocagwoMpe l6「图 3.使用 JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit (A048)检测 Jurkat 凋亡细胞中线粒体膜电位 的变化。

左图为正常Jurkat细胞(对照)流式细胞图，右图为使用10^M camptothecin诱导4小时后Jurkat 细胞流式细胞图4. TUNEL 法细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA细胞凋亡 时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以 在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素 (FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微 镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理TdT incorporalion o*EdUTP into dsDNA Fhjoreswn! deSection ofstrand breaks EdUTP with clfck ctiemistry(60 min) 印 min)Fix and Perm cedis应用实例：以TUNEL Andy Fluor™ 488细胞凋亡检测试剂盒为例。

图4,使用TUNEL Andy Fluor™ 488细胞凋亡检测试剂盒进行老鼠舌组织细胞凋亡检测结果三、细胞凋亡分析试剂盒的比较检测方法试剂盒名称样品类型检测平台产品优势Annexin V 法eGFP Annexin V and PIApoptosis Kit悬浮细胞、贴壁细胞流式细胞仪、荧光显微镜灵敏度高——采用Andy Fluor™ 染料标记，信号强；灵活性一一多色荧光标记，适用于不同的激发光源和滤光片；操作简单一一检测只需孵化过程，30 分钟内完成FITC Annexin V and PIApoptosis Kit流式细胞仪、荧光显微镜Andy FluorTM88Annexin V and PIApoptosis Kit流式细胞仪、荧光显微镜Caspase-3活性分析Caspase-3/7 Z-DEVD-R110Assay Kit细胞或组织裂解物；纯化的Caspase-3蛋白酶标仪荧光光谱仪特异性高 针对caspase-3/7特异性荧光底物；简单的操作流程一一可用于细胞裂解液，也可直接用于活细胞；快速检测——适用于高通量测试Caspase-3/7 Z-DEVD-R110HTS Assay Kit酶标仪荧光光谱仪LIVE Caspase-3/7 GreenApoptosis Assay Kit活细胞固定细胞荧光显微镜酶标仪特异一可以特异地检测caspase-3/7蛋白酶活性；简便一实验操作简单，免清洗步骤；适用性一适用于活细胞、固定细胞的细胞成像分析；容易区分活、死亡和凋亡细胞JC-1 Mitochondrial悬浮细流式细胞仪、荧操作简单一一只需加JC-1探针到活Membrane Potential胞、贴壁光显微镜、酶标细胞中，无需裂解或洗涤；线粒体膜电Detection Kit细胞仪检测灵活一一适用于流式细胞仪，荧位的检测光显微镜，96孔荧光酶标板；快速——只需30分钟TUNEL Chromogenic石蜡组织荧光显微镜宽广的应用：适用于石蜡包埋组织切Apoptosis Detection Kit切片、冰片，冰冻组织切片和细胞样本；冻组织切灵敏度高：可以检测到少量的凋亡细片、细胞胞群。

样本TUNEL Andy Fluor™石蜡组织荧光显微镜宽广的应用一适用于石蜡包埋组织TUNEL法488/ 594/ 647切片、冰切片、冰冻组织切片、细胞样本；Apoptosis Detection Kit冻组织切灵敏度高一可以检测到少量的凋亡细片、细胞胞群；样本荧光信号强一采用Andy Fluor™高性能荧光染料代替传统的荧光染料，具有明亮的荧光信号、光稳定性好、抗淬灭能力强等特点。