医院肿瘤个体化治疗检测技术指南.doc

医院肿瘤个体化治疗检测技术指南目 录1. 本指南使用范围 12. 简介 13. 标准术语和基因突变命名 13.1标准术语 13.2 基因突变命名 23.3 参考序列 23.4 各类变异 24. 分析前质量保证 54.1 样本类型及获取 54.2 采样质量的评价 64.3 样本采集中的防污染 64.4 样本运送和保存 65.分析中质量保证 75.1 实验室设计要求 75.2 检测方法 75.3 DNA提取方法与质量控制 135.4 RNA提取方法与质量控制 145.5 试剂的选择、储存及使用注意事项 145.6 核酸扩增质量控制 155.7 设备维护和校准 155.8 人员培训 155.9 方法的性能验证 166. 分析后质量保证 176.1 检测结果的记录 176.2 失控结果的记录与分析 176.3 报告及解释 176.4 记录保留 186.5 检测后基因咨询 186.6 样本（及核酸）保留与处理 186.7 检测与临床数据收集与分析 197. 肿瘤个体化治疗检测的质量保证 197.1 标准操作程序 197.2 质控品 197.3 室内质量控制 207.4 室间质量评价 207.5 PCR污染控制 21附录A：常见的检测项目 22A.1 基因突变检测项目 22A.1.1 EGFR基因突变检测 22A.1.2 KRAS基因突变检测 23A.1.3 BRAF基因突变检测 25A.1.4 C-KIT基因突变检测 27A.1.5 PDGFRA基因 29A.2 基因表达检测项目 30A.2.1 HER2基因表达 301）3+，HER2表达阳性； 312）1+或阴性，表达阴性； 313）2+时则需要进行FISH检测。

31A.3融合基因检测项目 33A.3.1 EML4-ALK融合基因检测项目 33A.4 基因甲基化检测项目 34A.4.1 MGMT基因甲基化检测 34第 37 页 共 39 页1. 本指南使用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，是国家卫生计生委个体化医学检测指南的重要内容，旨在为临床分子检测实验室进行肿瘤个体化用药基因的检测提供指导本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床分子检测实验室2. 简介肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础，以循证医学研究结果为依据，为患者提供接受正确治疗方案的依据，已经成为现代医学发展的趋势临床研究证实，通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因突变、基因SNP分型、基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用3. 标准术语和基因突变命名3.1标准术语1）基因（Gene）:是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA2）突变（Mutation）：是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的改变3）融合基因（Fusion gene）：是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程。

融合基因的表达产物为融合蛋白4）基因表达（Gene Expression）：是基因中的DNA序列生产出蛋白质的过程步骤从DNA转录成mRNA开始，一直到对于蛋白质进行翻译后修饰为止5）基因扩增（gene amplification）：为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程6）DNA甲基化（DNA Methylation）：为DNA化学修饰的一种形式，将甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5碳上DNA甲基化能在不改变DNA序列的前提下，将DNA甲基化状态遗传至下一代细胞或个体7）聚合酶链反应（PCR）：是一种体外扩增特异DNA片段的技术利用DNA在体外摄氏高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链8）质控品：是含量或成分已知的处于与实际样本相同的基质中的特性明确的物质，这种物质通常与其他杂质混在一起，专门用于质量控制目的的样本或溶液3.2 基因突变命名人类基因组突变学会（HGVS）已建立系统的基因突变命名方法具体基因突变命名方法可查阅网站http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html。

HGVS基因突变命名指南根据需求不断更新本文以2011年8月更新版本为准当描述某一序列改变时，其前缀表明其参考序列类型例如“g.”表示基因组序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示线粒体DNA序列，“r.”表示RNA序列，“p.”表示蛋白序列在数据库中的收录号以及版本号应当在实验记录报告中列出，当两种突变在反式（in trans）中检测到，则用方括号表示例如，CF突变为杂合性突变（508号苯丙氨酸缺失和1303号天冬酰胺被赖氨酸替代），则在DNA水平规范描述方式为c.[1521_1523delCTT]+[3909C>G]3.3 参考序列美国国立生物技术信息中心（NCBI）收录的参考序列编码具有权威性及唯一性其中前缀“NM_”表示为mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因组序列基因组参考序列应列出完整基因序列，包括5以及3非编码区（UTR）当使用某段编码DNA参考序列描述突变时，应选择合适的转录体，且转录体的起始转录点应当明确，例如选择最常见的转录体，或者是已知的最大转录体，或者具有组织特异性的编辑转录体当某一参考序列具有多种转录方式时，选择NCBI数据库里注释最全面的版本。

3.4 各类变异3.4.1 DNA序列变异术语规范DNA核苷酸用大写字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）来表示用正链来表示DNA序列当DNA序列改变时，以相应核苷酸所在位置及相应字母来描述>”符号表示“从某一变化至另一”在描述突变方式时，数字、字母、箭头、上标以及下标之间不应出现空格3.4.2 RNA序列变异术语规范RNA序列以小写字母a（腺嘌呤）、c（胞嘧啶）、g（鸟嘌呤）、u（尿嘧啶）进行描述RNA序列改变描述方式与DNA相类似具体术语可参阅HGVS网站（http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html）3.4.3蛋白质序列变异术语规范蛋白质序列改变通常以单个字母或三个字母（第一个字母大写）来描述尽管单个字母描述氨基酸明确无误，但是由于三联密码子相对于其编码的氨基酸存在冗余性，具体给出发生突变的三联体密码子可以更清楚地描述氨基酸改变方式例如，用来描述氨基酸的A（丙氨酸）、C（半胱氨酸）、G（甘氨酸）以及T（苏氨酸）可能会与核苷酸字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）相混淆3.4.4错义突变及无义变异术语规范由于三联体密码子的简并性，多个位点核苷酸的改变可能不影响最终氨基酸序列。

因此，应该分别从DNA水平和氨基酸水平描述突变从DNA水平对某一突变位点的描述方式包括碱基位点，正常碱基，“>”符号，突变碱基例如，某一蛋白第551号氨基酸残基由G（甘氨酸）突变为D（天冬氨酸），从DNA水平描述即c.1652G>A在氨基酸水平，由于错义突变的产物以氨基酸残基位点以及表示氨基酸的单字母或三联体密码子来描述表示方法是野生型的氨基酸、位点、突变氨基酸，三者之间不要有空格例如，p.Gly551Asp表示该蛋白中551号甘氨酸残基（G）被天冬氨酸残基（D）所代替无义突变表示方法与之相类似需要指出的是“X”符号代表终止密码子例如，p.Gly542X表示542位点的甘氨酸残基被终止密码子所代替3.4.5 缺失和插入术语规范缺失和插入突变分别用前缀“del”和“ins”来表示，并注明突变位点以及碱基例如，c.441delA表示在该DNA序列中441号位点发生A碱基缺失c.241_243delATC表示在该DNA序列中从241号到243号缺失ATC三个碱基在蛋白水平，上述突变描述方式为p.Ile24del，表示该蛋白质中第24号的异亮氨酸残基发生缺失indels”则表示该段序列缺失的同时有片段插入。

例如，234_239delAATTCGinsTA（或者234_239delinsTA）表示该DNA序列234至239号位点缺失AATTCG六个碱基，同时该段位点被新插入的TA碱基所替代3.4.6 移码突变术语规范移码突变用“fs”符号来表示fs*#”则用于进一步描述突变类型例如，p.His62Profs*21表示该蛋白发生移码突变，第62号氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸并产生新的阅读框架，终止于第62号密码子下游21号密码子处该突变也可简要描述为p.His62fs，即该蛋白从第62号密码子发生移码突变3.4.7 碱基重复序列HGVS推荐，核苷酸重复序列基因多态性描述时通常以一个重复序列为单元，后面加上“[重复的次数]”，如CGG[55]当重复序列的次数在一个范围之内时，需要在小括号“（）”中标注出可能的最少的和最高的重复次数，如某个人HTT基因中发现有12个和15个CAG重复，基因水平的表示如下：c.52CAG[12]+[15]，蛋白水平则表示为：p.Gln18[12]+[15]HTT基因的重复序列范围则描述为：c.52CAG(27_35) 或 p.Gln18(27_35)3.4.8 遗传药理学基因型术语规范最广泛使用的命名法描述遗传药理学基因型不同于其他遗传学基因检测，例如代谢相关基因细胞色素p450家族，人类细胞色素P450（CYP）等位基因命名委员会（http://www.cypalleles.ki.se）推荐用“*”命名，见图1。

在该系统中，最常见的等位基因被指定为“* 1”图1.细胞色素P4502D6等位基因命名规范 3.4.9 其他对于更复杂的突变，可参考HGVS（http://www.hgvs.org/mutnomen）建议的命名规则，解决其他复杂的变异的命名4. 分析前质量保证4.1 样本类型及获取4.1.1 新鲜组织(包括手术和活检组织)肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA在手术现场取样的情况也比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成由于组织样本通常需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解4.1.2 石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）10%中性福尔马林固定手术切除样本，按病理学操作规范进行取材制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。

在高灵敏度检测方法中，可考虑使用活检标本DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化，不能检出突变活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等活检样本，固定时间控制在6~24小时为佳4.1.3胸腹水等细胞学样本用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，也可在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲。