克隆实验细则_生物学_自然科学_专业资料.doc

准备：1、瓶子、量筒、钥勺、天平、摇床等；2、 50ml离心管、1.5mL的离心管，125uL的PCR管、各种枪头、培养皿；3、 超净工作台、酒精灯、蜡带封□膜、铝箔LB培养基：（1L）胰化蛋白腺：10g, Tryptone酵母提取物：5g, yeast extractNaCI： 10g放好药品（100mL 的培养基,加入 200uL 的 20mg/mL 的 X-Gal, 50uL 的 50mg/mL 的 IPTG,50uL 的1 OOmg/mL的Amp以后，振荡均匀，高压蒸汽灭菌120C （注意：高压灭菌，瓶盖要松， 用胶带黏住两端），22mino在60C时，转紧瓶盖，拿出置于实验台上固体培养基：LB固体培养基1L,和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度下降到55C之 前加好抗生素，并且倒板LB固体培养基倒板：1、 配制：lOOOmL培养基加入L5g琼脂粉2、 抗生素的加入：高压火菌锅后，待温度降到60C,将培养基拿出置于超净工作台中，大 概降到55C （手可以触摸加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并且充分摇匀3、 倒板：一般10mL到1个板了培养基倒入培养皿后，打开盖了，在紫外灯下照10—15mino4、 保存：用封曰胶封边，并倒置用铝箔包裹放于4C保存，一个月内使用。

一般克隆实验：超净工作台开启紫外提前半个小时1、 DNA目的片段：T-vector： 0. 5uL①DNA : 4. 5uL③2、 加入5uL Solution!②（离心）注意步骤1和2：在冰上操作，慢慢加入，因为 不稳定）3、 16C反应lh左右，如果目的片段太长，可以延长时间零下20C保存）4、 10uL述体系中然后和50uL大肠杆菌感受态cell,冰上静置30min,不可剧烈振动同时开启水浴锅，将SOC液体培养基放置在37笆烘箱中待用）5、 42C水浴Imin后，冰上静置Imino6、 将55uL的上述混企液体加入到500uL的SOC液体培养基中，摇床摇菌，37C,振荡培 养基lh或者lh以上（1801、）溶液有清澈变成稍显浑浊7、 离心3000r, 8min,丢弃上清，200i】L-300i】L混合液轻轻吹打，打入到铺有薄层固态培 养基的培养皿中，涂板，固态培养基中已经加X-Gal, IPTG, Amp0 37C过夜培养，4C保存8、 挑笛，用枪头挑出白色的菌•落，直接连枪头一起打入加有抗生素的液体培养基，培养基 置于lmL的离心管中，摇床培养4h, 37C, 220r,（抗性LB避光保存）。

溶液有清澈变为 稍显浑浊此时可直接拿出去测序，亦可以直接取2uL用于PCR.分了克隆实验步骤：1、 配制液体培养基（Amp+,无Amp）,固体培养基2、 配制好的培养基要分装在1.5mL的离心管中,-20C保存Amp：溶解lg的Amp与水中,定容至10mL,得到到浓度为100mg/mL的溶液,分装在1.5mL 的离心管中，-2（TC保存用的时候稀释2000倍，配成50ug/mL的工作用浓度储存液 的浓度为50mg/mL.IPTG:将5g溶于1L火菌水配制50mg/mL水溶液，过滤火菌后，按ImL分装，-20C避光保存工作浓度为50mg/mLoX-Gal：工作浓度20mg/mL,储存浓度20mg/mL, -20C避光保存转化实验：准备：DNA, Vector试剂盒（冰上操作）16C水浴，42C水浴无抗培养基（50mL X n） Amp+培养基（50mL X n）板，solutionl 5uL操作：1、DNA： 4. 5uL + Vector： 0. 5uL + solutionl： 5uL对照：Control insert： luL + Vector: 0. 5uL + dH2O: 3. 5uL + solutionl： 5uL2、 16 C 培养 30min3、 加入 lOOuL Cell,冰上放置 30min<,4、 42C培养60s,冰上放置Imino5、 加入 ImLLB 无抗,37C摇菌 lh, 180ro6、 8000r,离心 8min, 800uL 丢弃,200uL 吹打。

7、 涂板（抗）8、 挑菌，加入ImL抗性LBIPTG:是一种（3■半乳糖昔前的的活性诱导物质，当载体DNA以lacZ缺失，由于的细胞为宿主进 行转化时，如果在平板培养基中加入X-Gal和IPTG由于■半乳糖昔酶法人a•互补性，可 以根据师傅哦出现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体，此外还有一 lac等启动 了的表达载体的表达诱导物使用诱导的原理：E.coli的乳糖操纵了（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖昔酶、透酶和乙酰 基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节 基因II基因编码一种 阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态在启动序列P上 游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点由P序列、O序列和CAP结 合位点共同构成lac操纵了的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产 物的协调表达在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态此时，I序列在PI启动序列操纵下表 达的Lac阻遏蛋白与序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结 合，抑制转录起动当有 乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导在这个操纵了（元）体系中，真正的诱导剂并 非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经（3■半乳糖昔酶催化，转变为半乳糖后者作为一种诱导剂 分了结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与序列解离、发生转录异丙基硫 代半乳糖甘（IPTG）的作用与半乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十 分稳定，因此被实验室广泛应用首先把IPTG配制成50 mg/ml的水溶液，并进行过滤除菌后保存然后在100 ml的琼脂培 养基中，加入50 pl的上述溶液、200 pl的X-Gal （20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液） 和50 pl的Amp （100 mg/ml）,制作成IPTG、X・Gal、Amp平板培养基当DNA片段插 入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后, 涂布上述的IPTG、X-Gak Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出 基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）o。