Graves病动物模型建立机制与中药治疗研究进展.doc

Graves病动物模型建立机制与中药治疗研究进展【摘要】甲状腺功能亢进症，简称“甲亢”，系指山多种病因导致的甲状腺功能增强，其病 因有多种，而以Graves病最为常见为研究Graves病的发病机理，发掘有效的治疗手段， 近年来国内外学者对Graves病动物模型制备进行了大量探索并取得较大进展本文介绍制 备整体实验性Graves病的动物模型不同方法、基本原理及當用的具代表性的观测指标以及 近年來，中医药在治疗以Graves为主的甲状腺功能亢进症的研究进展关键词】甲亢；Graves；动物模型；中药；进展甲状腺功能亢进症(Hyperthyroidism,简称"甲亢”)系指山多种病因导致的甲状腺功 能增强，甲状腺激索(Thyroid Hormones, TH)分泌过多，造成机体的神经、循环及消化等 系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的临床综合征其特征有甲状腺肿大、基础代谢增加 和自主神经系统失常，与中医学的瘻病、瘻瘤、心悸、怔忡等相关Graves病(Graves Disease, GD),又称毒性弥漫性甲状腺肿，或Basedow病，是—•种以 甲状腺功能亢进为主征的器官特异性自身免疫性疾病现认为英临床表征为在环境与遗传因 素的相互作用下，机体免疫系统产生了针対促甲状腺激素(Thyroid-stimulating hormone, TSH)受体(Thyrotropin receptor, TSHR)的自身抗体(TRAb)。

其中,甲状腺刺激性抗体 (TSAb)可模拟TSH功能，导致甲状腺激素过度分泌现就近年来国内外学者对Gmves病 实验方法的相关研究及中药治疗甲亢的方法作简要综述1 GD动物模型建立的研究进展在研究疾病的发生发展机理的过程中，仅仅应用临床资料和人源材料来进行研究存在着 许多难以逾越的局限和障碍，研究实验性动物模型对于病机的剖析和新式治疗方案的制定有 着极其重要的意义尤其对于自身免疫性疾病研究，动物模型对耐受机制及免疫干预疗法等 的研究有着不可估量的作用1.1 Shimojo 模型自从Rose等人于50余年前报道实验性自身免疫甲状腺炎(experimemal autoimmune thyroiditis, EAT)的动物模型以來⑴，该模型即被长期应用于自身免疫性疾病的研究直到 1996年Shimojo模型见诸报道才有了真止意义上的GD动物模型⑵Shimojo模型将稳定转 染了人TSHR(human TSHR, hTSHR) cDNA和主要组织相容性复合体II类基因(major histocompatibility complex class II, MHC II)的成纤维细胞注射入 7 周龄的同源 AKR/N CH-2k)雌性小鼠，注射前经丝裂霉素预处理，每两周重复注射一次，共计六次，末次注射 后两周结束实验。

通过该方法，甲亢在大约25%的小鼠得以诱导发生1.2表达TSHR的细胞免疫1.2.1表达TSHR的成纤维细胞免疫Shimojo及其实验室以其研究揭示了 MHC II在Graves，病的发病中起到抗原提呈的关键 作用，为后来科研人员提供了思路而后较为接近的模型是KiW等⑶利用可表达hTSHR和 MHCII的成纤维细胞免疫六周龄的AKR/N(H-2k)雌性小鼠，部分纽.别加用含百口咳毒素 的明矶佐剂或弗氏完全佐剂，每两周重复注射一次，共计八次后两周处死小鼠免疫后11〜12 周15%的小鼠白发性死亡，并发现伴有甲状腺肿大第12周后30〜40%小鼠出现甲亢症状 1.2.2表达TSHR的M12细胞或HEK・293细胞免疫M12是一种来源于BALB/c小鼠的B淋巴细胞，Kaithamana等⑷用丝裂霉素处理表达 小鼠mTSHR的M12细胞(mM12)或表达人hTSHR的M12细胞(hM12),继V Xj BALB/c 小鼠进行腹腔注射进行免疫小鼠于实验第90天产生抗天然型TSHR的自身抗体，第180 天呈现明显的甲亢症状M12细胞本身即是一种抗原递呈细胞，而且其表而还可以表达MHC II分子以加强免疫反应。

HEK-293是人胚肾细胞，以衣达于HEK-293细胞的hTSHR的可 溶性胞外域免疫BALB/c小鼠，腹腔注射6次，经免疫的小鼠产生严重的甲亢，发病率达到 100%o1.2.3表达TSHR的树突状细胞免疫树突状细胞是垠强大的抗原递呈细胞，并在初次免疫反应中发挥重要作用Kita等⑸ 采取向同源雌性小鼠皮下注射经表达TSHR的重纽.腺病毒转染的树突状细胞的方法制备GD 模型，以探索树突状细胞对Graves＞甲亢的发生所发挥的作用树突状细胞从BALB/c小鼠 的骨髓前体细胞中获得，在三次免疫后35%的小鼠产生TSAb, T4水平升高，出现弥漫性增 生性甲状腺肿同时此研究也向前期对于GD甲亢的发生以Th2为主导的概念提出了质疑 与挑战，GD的病理生成町能以Thl型免疫反应为主1.3编码TSHR的基因疫苗免疫研究者将TSHR cDNA克隆到真核表达载体，再将载体注射到动物体内，感染宿主细胞 后在其上表达编码的蛋白，从而使动物获得免疫° Costagliola等⑹首先用此法免疫BALB/c 小鼠，结果显示小鼠只产生了甲状腺炎，并未发生甲亢该纟I［研究人员继而采用6周龄的杂 交NMRI小鼠，结果发现所有小鼠均产生能识别稳定转染的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞表面上表达的重纽受休的抗休。

所有发生甲亢的小鼠出现甲状腺肿大，淋 巴细胞浸润，可见Graves，病眼征，包括水肿，无定形基质的沉积，眼外肌细胞浸润等⑺1.4腺病毒表达TSHR免疫腺病毒载体具有以下多种优点：①宿主范围广，对人致病性低；②在增殖和非增殖细胞 中均能感染和表达基因；③与人类基因同源；④不整合到染色体中，无插入致突变性；⑤能 有效増殖，滴度高；⑥能同时表达多个基因，⑦能在悬浮培养液中扩增等，故现在越来越广 泛地应用于人类及非人类蛋白的表达凶Nagayama等⑼构建了 TSHR全长腺病毒载体免疫 小鼠GD模型，该研究同时反映GD发病存在易感性基因Chen等冋 用TSHR A亚单位实 现了 GD模型的建立之后的许多研究验证了该结论，运用TSHR A亚甲位进行免疫较全长 TSHR在GD模型的建立上有更高的成功率近期有研究进一步支持该观点，提出TSHR的 A亚单位是通过促进体液免疫中自身抗体的亲和力成熟导致GD的发生(⑴1.5转基因模型1.5.1 TSAb转基因之前的研究运用TSHR免疫方法可获得暂吋性的甲亢，可是这样的模型不利于透彻地 理解自身免疫反应的发生发展Kim-Saijo1121^取患者来源的TSAb,使其表达于转基因鼠的 B细胞。

以造成转基因小鼠模型在转基因鼠休内衣达人甲状腺刺激性抗休(human TSAb, hTSAb)造成许多甲亢表现，说明该转基因小鼠模型可基本模拟出Graves，病1.5.2 GD易感基因的转基因小鼠模型在模型的建立研究中，各种方法综合运用，可以发挥出更好的效果Flynn ^fl3］对人类 白细胞抗原HLA-DR3转基因小鼠进行TSHR-cDNA免疫，小鼠出现Tq水平升高等甲亢症 状，该实验同吋验证了 HLA-DR3 (主要组织相容性复合物-II的等位基因)是GD的易感基 W=该模型并非典型的转基因小鼠模型，因为仅通过HLA-DR3转基因无法实现GD模型， 只是使小鼠具有GD易感基因1.6电穿孔法优化基因免疫随着研究的深入，科研人员通过各种手段优化已有的实验方法，以期达到更好的免疫效 果或模型的稳定性Kaneda等〔刊通过电穿孔导入进行基因免疫法运用于GD模型的建立实 验，将插入hTSHR或hTSHR289片段的衣达载体经山电穿孔的方法导入BALB/c小鼠，实 验发现用hTSHR基因免疫的小鼠中有12.0-31.8%,而用hTSHR289基因免疫的小鼠中有 79.2-95.7%出现TSAb导致总J水平增髙，甲状腺滤泡增生，出现异常上皮等甲亢症状，H TSAb可在体内维持存在超过八个月。

这些结论都提示体内电穿孔导入基因的方法的高效性, 有利于对于GD疾病的研究1.7以TG免疫诱导GD类似模型以上所述模型基本都是以TSHR为抗原引起的免疫反应，因为GD的主要特征即是山于 TSHR的自身抗体模拟TSH的作用导致甲状腺的过度刺激及甲状腺功能亢进而同时，亦 有一 TG诱导GD形成的报道Endo等问利用TG免疫AKR/N小鼠，造成了类似GD的动 物模型三个月后发现在所有被免疫的小鼠血清中抗TG抗体均呈阳性，FT3, FTa均显著高 于对照纽.，吸碘率也有所升高该纽•科研人员重复实验，经TG免疫的11只AKR/N小鼠中 的4只与10只C57BL6小鼠中的3只得到了类似的结果，验证TG免疫亦可诱导出类似甲 亢的小鼠模型2研究热点概述2.1模型的评价标准模型的建立是否成功的评价标准莫衷一是，通常最为关键的有：①自发性的模型应当比 诱导型好，而现有的自发性模型还不多见，应用也不广泛；②该模型应当具备较好的重现性, 从这个角度看腺病毒-TSHR289造模是较为稳定可重复的方法；③在该模型中疾病的发生率 应该足够高，以保证有意义的病理病机研究观察和新疗法疗效的判断，前述的几种模型基本 呈现发生率随技术手段的发展而逐渐升高的趋势;④该模型最好可以广泛适用于多种不同动 物品系,Shimojo模型和M12细胞-TSHR模型均只能应用于同源小鼠，存在较大的局限性【⑹。

另外对于GD模型是否应包含甲状腺炎症模型也有争议2.3耐受机制的研究进展一般来说，对自身抗原的免疫耐受分胸腺和外周两步进行胸腺中正在分化的T细胞 如果表达出针对胸腺内自身抗原高亲合力的特异性抗体，这样的T细胞就将被淸除，造成 对自身抗原在胸腺内免疫耐受自身免疫调节因子((he Au〔oimmune Regulator, AIRE)阳性 胸腺髓质上皮细胞参与这个过程AIRE作为一种转录因子，在各种纽.织特异性自身抗原的 异位表达中发挥了重要的作用(⑺Misharin等卩引通过实验考察甲状腺白身抗原的胸腺内转 录情况，发现免疫耐受相关机制无法解释TSHR-DNA基因免疫在不同品系小鼠(BALB/c 和C57BU6)的不同结果，也无法说明腺病毒TSHR引起的甲亢的易感性与抵抗性研究中 发现可能是MHC基【大I与TSHR T细胞表位的不同导致了 TSHR抗体的免疫反应过程所以 推论可能是抗原本身而非胸腺内免疫耐受的作用调控免疫反应2.4T细胞的调节机制对于GD是山Thl述是Th2主导的讨论已持续许久免疫反应可被分为Thl与Th2两 大亚型山IFN-y和IL-12等诱导分化成的Thl主耍参与细胞介导的免疫反应，血受IL-4 调节的Th2常参与一些抗体介导的体液免疫反应。

GD山抗TSHR自身抗体介导发生，根据 前述理论GD被普遍认为是山Th2主导的自身免疫疾病然而现在发现在人类的相关研究 中TSAb在多数病人(非全部)为IgGl这种Thl的亚型1叫 关于人类Graves5眼病的研究 结果显示细胞因子形式会随着病程不同而发生转变，在疾病早期Thl为优势亚型，而到了 病程后期Th2则成为优势亚型【2叫 所以出现前述“孑盾”的原理可能山于病程发展与Th的 优势亚型相关另外，以上情况可以推测GD所涉及的免疫反应是-种不同与经典的Thl/Th2 免疫反应的另一种较为复杂的模式一种可能性是Thl7细胞的参与，如I型糖尿病，关节 炎和EAE等白身免疫病曾被认为山Thl细胞介导的，而现在发现是Th 17细胞在发病中发 挥着关键的作用⑵】在对严重的桥本氏甲状腺炎与GD患者相关细胞因子的研究中发现， 甲状腺炎患者Thirrh2的比值以及GD患者Thl7细胞所占比例有显著增加㈤相信今后关 于Th 17细胞的研究可能成为自身免疫甲状腺疾病研究。