细菌漆酶LacA在大肠杆菌中异源表达.ppt

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达 组员 按学号排序如下 刘艳红 王瑞 姚伟静 张明珠 康兴 程飞 孙元元 刘燕红 程旭 査倩 潘伟民 傅声祥汇报人 程飞 一 实验简介 漆酶 Laccase 是一种含酮的多酚氧化酶 能够催化多种酚类和非酚类化合物发生氧化 同时伴随由分子氧还原成水 漆酶一般由500 600个氨基酸组成 不同来源的漆酶氨基酸序列的相似程度较低 但是其催化位点序列相当保守 对漆酶的晶体结构进行研究 发现其分子具有3个铜离子结合位点 共结合四个铜离子 野生漆酶的产量低 重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法 本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段 以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列 并且通过序列拼接获得完整的LacA基因序列 并转化大肠杆菌 进行异源高效表达 二 实验目的 获得细菌LacA基因 LacA在大肠杆菌中异源表达 三 实验原理 DNA重组 简并引物 酶 TA克隆 将3 端具有单个 A 突出末端的PCR产物克隆到3 端具有单个 T 突出末端的载体的克隆法 反向PCR 反向PCR是一种新型的基因扩增方法 它能扩增一段已知序列旁侧的DNA 载体选择 蓝白筛选 质粒载体含有大肠杆菌 半乳糖苷酶基因 lacz 的启动子 受IPTG诱导 及其编码 肽链 半乳糖苷酶的氨基末端短片段 的DNA序列 特称为lacz基因 受体大肠杆菌细胞的 半乳糖苷酶发生了突变 失去的氨基末端 当lacz基因编码的 肽链同失去了正常氨基末端的 半乳糖苷酶突变体互补时 便会产生出有活性的 半乳糖苷酶分子 在IPTG诱导下 会启动表达 分解X gal产生蓝色背景 当MCS中插入外源基因后 会阻断 肽链合成 不能形成互补 不能产生功能活性的 半乳糖苷酶 也就不会产生蓝色背景 所以含有重组质粒载体的克隆是白色的 四 实验材料 1 实验仪器 1 超微量分光光度计 2 制冰机 3 高压灭菌器 4 PCR仪 5 电子天平 6 磁力搅拌器 7 电泳仪 8 冷冻离心机 9 高速离心机 10 凝胶成像系统 11 冷冻研磨仪 12 超净工作台 13 烘箱 14 液氮罐 15 pH剂 2 实验试剂 1 载体 质粒pMD18 T 质粒pET 28a 2 产漆酶LacA细菌 实验室自备 3 限制性内切酶 BamHI Sal 4 T4DNA连接酶 TaqDNA聚合酶 5 0 1mol LCaCl2溶液 6 LB琼脂固体平板 含Kana 7 LB液体培养基 8 20mg mLX gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 9 200mg mLIPTG 异丙基硫代 D 半乳糖苷 10 琼脂糖 11 无菌双蒸水 12 JM109感受态细胞 13 卡那霉素50mg L 14 液氮 15 合成引物 16 PARAFILM 17 Tubes 18 溴化乙锭 19 Agarose 20 Sodiumchloride 21 TRYPTONE 22 YEASTEXTRACT 23 TE缓冲液T10E1 24 甘油 25 CutSmartBuffer 26 ABTS 27 上样缓冲液 28 T4DNALigaseBuffer 29 Trans2KplusDNAMarker 30 2XPowerTaqPCRMaster 31 酚 氯仿 异戊醇 32 高纯质粒小量制备试剂盒100次 33 普通DNA产物纯化试剂盒 离心柱形 34 乙醇 35 裂解液 40mMTris 醋酸 20mM醋酸钠 1mMEDTA 1 SDS pH8 0 36 Tris 饱和酚 氯仿 五 实验步骤 一 依据蛋白质保守区设计引物 二 PCR扩增保守区之间的基因序列 三 反向PCR获得全长基因 四 构建重组表达载体 五 异源表达以及蛋白活性检测 1 引物设计原则 2 上游引物与下游引物 1 碱裂解法提取细菌基因组DNA 2 PCR扩增保守区之间的序列 3 胶回收以及纯化DNA 4 目的片段与载体连接以及目的片段测序测序 1 反向PCR引物设计 2 细菌基因组酶切 3 自身环化连接 4 反向PCR 5 测序以及序列拼接获全长基因 1 细菌基因组DNA提取以及引物设计 2 表达载体选择 3 获得LacA基因并与载体连接 4 阳性重组子筛选 1 异源表达 2 LacA蛋白分离纯化 3 LacA活性检测 一 依据蛋白质保守区设计简并引物 1 依据蛋白质保守区设计简并引物2 上游引物以及下游引物 1 依据蛋白质保守区设计简并引物 引物设计原则 尽量降低简并度 起始密码子ATG 终止密码子TAA TAG TGA不使用 密码子偏好性 大肠杆菌中的稀有密码子 2 上游引物PF M代表AorCY代表CorTH代表AorCorTD代表AorGorTN代表GorAorTorC红色代表不可用FR CAYTGGCAYGGNATHMGNYT简并度 576 4用次黄嘌呤代替N 因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对 降低简并度 5 3 下游引物PR 3 5 R代表AorGFR TGRTCNGTNACRTGRCARTG简并度 256 二 PCR扩增保守区之间的基因序列 2 PCR获取保守区之间的序列 1 提取细菌基因组DNA 利用SDS法 3 胶回收以及胶回收纯化试剂盒纯化DNA 4 目的片段与载体连接以及目的片段测序测序 1 SDS法提取细菌基因组DNA 1 5ml菌液4 12000rpm离心30sec 加入400 l裂解液 用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解 37 水浴30min 加入X l的5MNaCl溶液 颠倒试管 充分混匀后 13000rpm离心15min 取上清 纯化DNA 等体积苯酚 氯仿 异戊醇 沉淀DNA 1 10体积3mol lNaAc 2 5倍体积预冷无水乙醇 70 乙醇沉淀 50ulTE含20ug mlRase 20 备用 2 PCR获取保守区之间的序列 TaqDNA聚合酶能产生3 A的尾巴 因此PCR产物可以用于TA克隆首次使用PCR之前 要仔细阅读说明书 除特别指出外 加入反应成分的每一步都需在冰上操作 加入TaqDNA聚合酶后 都要混匀体系 并且用离心机轻甩一次 3 胶回收以及纯化DNA 配置含1 agarase的凝胶 将PCR产物点样至胶孔里 添加Loadingbuffer 并点上marker PCR试剂盒回收目的片段 测出DNA浓度 注意A260 A280 不小于1 8 以及A260 A230的值 不小于2 0 DNA样品添加上样缓冲液 其中含有甘油或者蔗糖 帮助DNA沉入胶的底部 其中还有溴酚蓝或者二甲苯青 指示样品迁移情况 5 端磷酸化 纯化 等量的苯酚 氯仿 异戊醇沉淀 1 10体积3mol lNaAc 2 5倍体积预冷无水乙醇 TE溶解 回收DNA10Xbutter10mmol LATPT4多核苷酸激酶20U PCR产物回收 a 熔化 3倍体积bufferDE A 75 温浴 b 结合 混合液加入DNA制备管12000rpm 1min 3 洗涤 加500 lbufferW1 加700 LbufferW2 重复一次 3 洗脱 75 无菌水洗脱 12000rpm 1min 收集 测浓度 T克隆载体 1 载体用EcoRV产生突出的T2 经Taq聚合酶PCR产物3 段有突出的A 3 经连接酶连接就能将基因片段和载体连接 4 目的片段与载体连接以及测序 连接产物转化E coliJM109感受态细胞设立对照 回收产物连接到pMD18 T载体上 提取质粒 试剂盒 高纯质量少量制备试剂盒 离心柱型 测浓度 测序 载体 外源基因 摩尔比 1 2 1 10载体 外源片段 载体含量 ng X插入片段的长度插入片段所需量 ng X载体长度 连接产物转化JM109感受态细胞 a 加10ul连接产物到含有50ulcompetentcell的1 5mlEP管中 冰上放置30min b 将EP管放入42度水浴锅中热激45sc 重新放入冰中2min d 加入1mLLB培养基 放到37度复苏1h e 将复苏后的菌体离心收集 涂含有Kana抗生素的LB固体板 f 将板放到37度培养箱培养16h后 对长出来的菌落做菌落PCR鉴定阳性克隆 19 三 反向PCR获得全长基因 1 反向PCR原理 2 PCR引物设计 3 细菌基因组酶切 4 自身环化连接 5 长距离反向PCR 6 测序以及序列拼接全长基因 1 长距离反向PCR原理 2 反向PCR引物设计 1 根据LacA的部分基因序列 设计两个特异的反向PCR引物 由于测序结果未知 所以此处无法给出具体的引物序列 2 IPs 3 IPa注意 IPs和Ipa3 方向是相互背离的 不同于常规的PCR 3 细菌基因组酶切 1 选用4种限制性内切酶 X1 X2 X3 X4 对基因组的DNA分别进行单酶切 前提是保证这四种酶在LacA上没有酶切位点 方法 通过细菌基因组序列以及保守序列周围的序列 根据一般漆酶基因的大小 确定这四种限制性内切酶 2 酶切产物纯化 PCR产物纯化试剂盒 3 测浓度 4 自身环化连接 1 自身连接产物纯化 TIANquickMidiPurificationKit普通DNA产物纯化收试剂盒同前面内容 2 测浓度 5 反向PCR 1 配置含1 agarase的凝胶 2 将PCR产物点样至胶孔里 添加Loadingbuffer 并点上marker 染料使用EB 3 用刀片切取含有目的片段的琼脂糖凝胶 试剂盒纯化DNA 4 DNA磷酸化处理 5 测浓度 连接产物转化E coliJM109感受态细胞 回收产物连接到pMD18 T载体上 提取质粒 试剂盒 高纯质量少量制备试剂盒 离心柱型 测浓度 测序以及序列拼接 序列拼接采用DNASTAR软件的SeqMan程序 由重叠部分即可拼接出完整的全长基因 6 测序以及序列拼接全长基因 获得的全长基因提交GeneBank 四 构建重组表达载体 1 细菌基因组DNA的提取以及引物设计 2 表达载体的选择 pET 28 a 3 获取LacA基因并与载体连接 1 细菌基因组DNA的提取以及引物设计 1 SDS法提取细菌基因组DNA 2 引物设计原则a 由已知的LacA基因序列设计引物 b 在引物5 端设计酶切位点 以及添加保护碱基 软件使用Primer5 FPa5 CGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 含有BamHI酶切位点 FRa5 ACGCGTCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 含有SalI酶切位点 2 表达载体的选择 pET 28a 3 获取LacA基因并与载体连接 1 PCR获得LacA基因序列 2 双酶切PCR产物 试剂盒纯化 测浓度 3 双酶切载体 纯化 测浓度 4 LacA与载体连接 5 转化JM109 4 阳性重组子筛选 1 重组子涂平板筛选重组子的培养基 Kana50ug mg x gal是2 每个平板取40uL涂布 IPTG是20 每个平板取7uL涂布 特注 Kana添加是在倒平板温度降到可以用手触摸再添加 X gal和IPTG在平板凝固之后涂布 2 设对照组 阳性对照与阴性对照 3 在Kana抗性的平板可以生长 阳性菌落产生的是白色菌落 4 阳性重组子进行菌落PCR鉴定 5 液体扩大培养 提取质粒 测序 涂布添加X gal IPTG和Amp的平板 五 异源表达以及蛋白检测 挑选的白色菌落 扩大培养 提取质粒 测序 如果测序为LacA则保存菌种 1 5 甘油 菌种保存于 70 冰箱 异源表达 液体培养 大量产生发酵液 1 异源表达 2 LacA蛋白的分离纯化 1 实验材料准备 LB培养工程菌并离心收集 2 预处理 清洗菌体并重悬 3 蛋白质粗提 超声破碎离心 4 蛋白质粗分级 镍亲和层析 5 梯度咪唑溶液洗脱 6 蛋白质鉴定SDS PAGE 质谱 3 LacA活性检测 测定漆酶活性的方法有HPLC法 测压法 分光光度法 级谱法等 目前常以3 乙基苯并噻唑 6 磺酸 ABTS 为底物 测定酶对其的氧化速度 具体方法反应在25 下进行 在总反应体积3mL中 含有2mL溶液0 5m。