第三节 害虫抗药性形成机制.ppt

第三节 害虫抗药性机理,,一、害虫抗药性形成的学说（I）,1、前适应学说：认为昆虫种群当中存在与使用杀虫剂无关的抗性强的个体，由于使用了杀虫剂，使这些个体存活下来，并繁殖后代，多次重复的形成抗性品系选择学说）,,2、后适应学说：（诱导变异学说）昆虫种群中原来不存在抗性基因，而由于使用杀虫剂，在药剂的诱导下，使昆虫某些个体发生变异（突变）而产生抗性基因3、基因复增学说：认为昆虫本身存在抗性基因，但杀虫剂引起了基因复增，这些复增的基因可以：①转移到不同的染色体上②发生突变，产生改变的酶和蛋白质③进一步复增④三者或任意两者同时发生基因复增后抗性有量的变化如：桃蚜、库蚊的酯酶基因的扩增4、染色体重组学说：（染色体畸变） 由于染色体易位和倒位产生改变的酶或蛋白质，引起抗性的进化 即由于染色体发生断裂时，在断裂处暴露未配对的碱基，通过H键和其它发生反应（氢键具有粘合性），使染色体在重组过程中出现的倒位，而增强抗性Hardy-Weinberg law种群遗传学的基本定律,①没有突变发生②没有新基因的引入或旧基因的消失③没有选择作用④种群是一个大种群⑤种群内的个体是随机交配的,如果发生突变有新基因引入强大的选择压等,一个种群的基因频率就会维持世代平衡。

种群的基因频率在种群中增加的过程二、害虫抗药性的形成因素,至少应包括3个因素：①变异②遗传③选择,变异,因为变异，才有抗性基因如果都是敏感基因，就没有可供选择的对象，不能使抗性形成；如果都是抗性基因，无论怎样反向选择，不能使抗性消失遗传,被选择的性状必须是能遗传的如果在选择以后，这一性状在下一代中不再出现，选择就不起作用选择一般是对表现型进行的，有的表现型的性状可能是不能遗传的在抗性形成中，表现型的决定因素是抗性基因，它是能遗传的选择,选择起了定向的作用，即使基因频率向一个方向发展，逐代累加如果这一代选择抗性，下一代也选择抗性，方向一致，抗性基因频率就会增加；如果这一代选择抗性，下一代选择敏感性，那么抗性就不会形成三、影响抗药性形成的有关因素,1、药剂的选择压：（药剂因素）①使用药剂的次数和浓度，药剂使用的次数越多，浓度越高，抗性发展越快亚致死剂量不产生抗药性②药剂的持效期：残效期的药剂，如果施药面积大，昆虫每年的世代多，易产生抗药性2、昆虫的生物学特性：（生物学因素）,①迁飞习性：具有迁飞习性的昆虫，由于抗性基因被稀释，则抗性发展缓慢，反之则发展迅速②繁殖方式：两性生殖，抗性发展慢（纯合度减小）孤雌生殖，抗性发展快，抗性指数高。

③繁殖世代：世代数/年多，抗性发展快 世代数/年少，抗性发展慢3、抗性基因频率：（遗传因素）①抗性基因频率高，抗性种群发展快②抗性基因是显性基因抗性种群发展快③抗性基因数量多，易产生抗性易形成抗性种群）4、代谢抗性：MFO（1）O－，S－，N－脱烷基作用，如久效磷，涕灭威2）烷基，芳基，羟基化作用，速灭威，克百威3）环氧化作用，艾氏剂4）增毒氧化作用，亚砜，砜四、昆虫抗药性机理,1.行为改变在药剂的选择压力下，那些有利于昆虫生存的行为得以保存和发展，从而使昆虫种群中具有这些行为的个体增多 例如美国乔治亚州用马拉硫磷糖浆诱铒防治家蝇，起初效果很好，2年后失效经研究发现，大多数家蝇虽然能飞向诱饵，但不在诱饵上着落，而用敌百虫和敌敌畏作对照却没有这种现象，这就是一种由家蝇行为发生改变而获得的行为抗性2.穿透降低杀虫剂穿透速率的降低，包括两种类型：杀虫剂穿透昆虫表皮的速率降低；杀虫剂对神经系统穿透作用降低3.解毒能力增强杀虫剂进入昆虫体内到达靶标之前，在体内被各种代谢酶系如多功能氧化酶羧酸酯酶等代谢解毒力增强4.靶标敏感性降低杀虫剂的作用靶标发生改变，从而对杀虫剂不敏感。

如有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标乙酰胆碱酯酶的敏感度降低是昆虫对这两类杀虫剂产生抗药性的机理昆虫抗药性可看作是昆虫的一种瞬间进化现象根据抗性机理性质将其分为：行为抗性生理抗性代谢抗性根据抗性的分子机理将其分为：代谢抗性靶标抗性,分子毒理学研究表明, 抗性产生的机理还可分为对杀虫剂和靶蛋白或酶的转变敏感性的转化靶蛋白的过量生成损伤点的修复从基因水平分析, 3 类突变也可使昆虫产生抗性: 基因扩增,基因表达改变基因结构的改变一）代谢抗性的分子机理,代谢抗性的分子机理是指由于解毒酶活性增高而对杀虫剂代谢加速所产生的抗性其所涉及的解毒酶系主要有以下3 大类: 细胞色素P450 单加氧酶系(P450s) 非专一性氧酶系 谷胱甘肽S2转移酶系(GSTs)在许多情况下, 抗性的产生是由于昆虫对杀虫剂的代谢能力提高, 代谢杀虫剂的解毒酶使有毒的外来化合物经过氧化、还原或水解后,其产物的水溶性增高, 使它们更容易从昆虫体内排出1. 细胞色素P450 氧化酶系,细胞色素P450(Cyt-P450) 广泛分布于各种生命形式中它是昆虫体内的微粒体多功能氧化酶(MFO) 酶系中的重要组成部分 1989 年Feyereisen 等首次从家蝇Muscadomestica 中分离出重要的P450 的cDNA , 并进行了序列分析。

他们的策略是选用具有高水平P450 的抗性品系, 再用苯巴比妥诱导, 进一步提高P450含量这样就加大了从cDNA 表达文库中筛选到cDNA 克隆的可能性当时的家蝇P450 基因被称为CYP6A1.,抗性品系细胞色素P450 氧化酶系的基因表达,比较了15 个不同品系的家蝇中P450基因CYP6A1 的表达, 发现：虽然在大多数的情况下, 抗性品系中CYP6A1 mRNA 比感性品系中高,但是CYP6A1 的表达与抗性之间并不一定都有相关性在抗性品系中CYP6A1 mRNA 的升高并不是基因扩增的结果, 而可能是由染色体Ⅱ上的调节因子所控制的问题？,CYP6A1 和CYP6D1 两个基因的调节方式是相似的, 但两者的反式作用因子是否为同一个基因的表达产物? 它们如何识别不同染色体上的CYP6A1 和CYP6D1 ? 杀虫剂又是如何作用于这些因子而使昆虫过度表达不同的P450 基因？,2. 谷胱甘肽S-转移酶(GST),谷胱甘肽S-转移酶(GST),催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物的亲核加成反应的酶,,功能,外源化合物生物转化药物代谢保护免受过氧化作用损害,（二）靶标抗性的分子基础,靶标抗性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的一个极为重要的生理生化机制, 已在多种昆虫对多种杀虫剂的抗性中发现。

如拟除虫菊酯和DDT 抑制Na +通道有机磷和氨基甲酸酯抑制乙酰胆碱酯酶AChE 环戊二烯杀虫剂抑制GABA 受体,1. Na + 通道,Na + 通道是一个大型膜载蛋白,也是DDT和拟除虫菊酯的主要靶部位, 因其敏感性降低而引起抗性, 这种类型的抗性一般称为击倒抗性(kdr) 使用Sch 克隆从果蝇基因文库中分离出sch 基因, 发现抗性果蝇Na + 通道ⅢS5 到ⅢS6之间有一个活跃的突变, 使得天冬氨酶被天冬酰氨酸取代Na + 通道,Taylor 使用根据果蝇paraα- 亚单位基因的第四跨膜肽链的部分序列合成的PCR 引物,从烟芽夜蛾Heliothis virescens 基因库中扩增Na + 通道片段, 并用该片段从基因库中筛选出了一个被称为hscp 的8kb 克隆, 获得的证据表明烟芽夜蛾的拟菊酯抗性与para 类似的Na + 通道基因是相联系的 Williamson 等也对家蝇Na + 通道基因的一部分进行了cDNA 克隆, 称之为Msc , 该基因克隆与果蝇para Na + 通道基因异常相似, 有99 %的氨基酸相同, 对敏感家蝇kdr 和super-kdr 家蝇品系Msc 位点RFLP (限制性片断长度多肽性)的鉴定分析和有控杂交表明, 击倒抗性与此Na + 通道基因是密切相关的。

目前Na + 通道基因部分片段克隆的分离研究均表明击倒抗性位点与Na + 通道基因位置是一致的或紧密连锁的2. 乙酰胆碱酯酶(AChE),酯酶是指能水解羧酸酯键和磷酸酯键的水解酶 乙酰胆碱酯酶(AChE) 是有机磷和氨基甲酸酯作用的靶部位, 它们通过抑制中枢神经系统(CNS) 中AChE 对神经递质ACh的水解作用使乙酰胆碱(Ach) 永远结合在乙酰胆碱受体(AchR) 上, 干扰和最终阻断突触传导AchE的作用（与底物Ach作用步骤）,①AchE与底物形成复合物②酶与乙酰基结合，形成乙酰化酶，放出胆碱③水解反应：乙酰化酶被水解，形成乙酸，恢复原初酶状态有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂对AchE的抑制作用,有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂对AchE的抑制作用,有机磷及氨基甲酸酯类与Ach一样，都是AchE的底物，所不同的是Ach是正常的底物，有机磷及氨基甲酸酯类是不正常的底物，AchE分解三者的速度不同，分解Ach最快，氨基甲酸酯类次之，最后是有机磷甚至有时AchE不但不能分解有机磷及氨基甲酸酯类，反而被有机磷及氨基甲酸酯类抑制其活性而失去作用，使信息传导反阻有机磷与AchE形成磷酰化酶后，使AchE不能起作用，失去活性，造成突触间大量的Ach积累，使正常的神经传导中断。

氨基甲酸酯类抑制AchE形成氨基甲酰化酶，但是不如磷酰化酶稳定，AchE易复活据测定使AchE活性恢复50%只需20s, 有机磷形成的磷酰化酶恢复50%需几天氨基甲酸酯类分子结构式中，要求碳原子的正电性酸性基团吸引电子的能力也以酯键稳定为宜酶的复活与老化,酶的复活：被抑制的AchE靠水解作用而使酶恢复活性，称酶复活高等动物农药中毒后，被抑制的AchE可用化学药物使酶复活，有些药物已作为高等动物农药中毒后治疗的药剂，这些药剂都是亲核试剂，主要作用是攻击磷化酶中的P原子，从而取代P原子酶的老化：磷酰化酶在恢复的过程中，可转变成另一种结构，解毒药物不能使AchE复活，则称为酶老化因此，高等动物有机磷农药中毒后，抢救要在酶老化之前酶老化的原因：主要是磷酰化酶的脱烷基反应解毒药物只认EP，而对脱烷基的EP不起作用，AchE不能复活Fournier 等从马拉硫磷抗性果蝇品系M Ⅱ19 中克隆了突变AChE 基因, 经与敏感果蝇AChE基因比较, 发现有一个点突变, 导致了第368 氨基酸位置上的苯丙氨酸(Phe) 被酪氨酸置换, 并证实Phe 368 与果蝇AChE 的催化特性有关 Mutero在体外表达果蝇AChE 时, 发现第109 位的酪氨酸被天冬氨酸置换也可使AChE 对几种有机磷的敏感性下降。

同时抗性个体中可变碱基加工以及顺反子内重组, 使昆虫能适应杀虫剂的选择作用总之, AChE 变构的原因是AChE 结构基因天冬氨酸导致了多点突变, 且同一品系内突变的增加与重组, 对抗性有显著的强化作用3. 水解酶类,昆虫体内的水解酶系可分为3 类：磷酸三酯水解酶、羧酸酯水解酶和酰胺水解酶磷酸三酯水解酶的种类多样,这些酶对有机磷杀虫剂分子有两个作用部位: 一是将与磷原子相连的基团X 去掉,生成二烷基磷酸和HX; 二是通过水解将与磷原子相连的烷基脱去,生成去烷基衍生物和酯羧酸酯水解酶是将有机磷杀虫剂分子中的酯键断裂酰胺水解酶作用于杀虫剂分子的酰胺基部位,使酰胺基断裂生成相应的酸酯酶和羧酸酯酶活力增加以及乙酰胆碱酯酶(AchE) 对杀虫剂的敏感性降低是棉蚜( A phis gossypii Glover) 对有机磷杀虫剂产生抗性的原因;棉蚜对溴氰菊酯的抗性是由于羧酸酯酶的不敏感性降低而引起的; 羧酸酯酶也参与了桃蚜对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性的形成和小菜蛾对定虫隆抗性的形成;阿维菌素类杀虫剂的抗性产生与羧酸酯酶的活性增强有关。