普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤.docx

八-----WORD格式--可编辑--专业资料二 普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通 PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放 大特定的DNA片段可看作生物体外的特殊DNA复制DNA聚合酶(DNA polymerase I )最 早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的 初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性 的聚合酶链式反应现今所使用的酶 (简称 Taq polymerase), 则是于 1976 年从温泉中的细菌 (Thermus aquaticus)分离出来的它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛 运用则于80年代之后PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe提出他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验而现 今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司， 因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。

Dr. Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇 相关的论文此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望 其项背随后 PCR 技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技 术Mullis也因此获得了 1993年诺贝尔化学奖2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核 苷酸引物PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经 加热至93弋左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加 热变性成单链后，温度降至55弋左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸： DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱 基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性 --退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍3 PCR反应体系与反应条件3・1标准的PCR反应体系 10x扩增缓冲液 10pl4种dNTP混合物200pl 引物 10~100pl模板 DNA 0.1 ~2pgTaq DNA 聚合酶 2.5 plMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水 100 pl3.2 PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为 一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90弋-960 :双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2•退火（25弋-650 :系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链3•延伸（70°C-75°C）:在Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从 引物的5端-3’端延伸，合成与模板互补的DNA链每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍现在有些PCR因为扩增区很短，即 使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在 60C-65C间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

4 PCR反应特点4.1特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：① 引物与模板DNA特异正确的结合；② 碱基配对原则；③ Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④ 靶基因的特异性与保守性其中引物与模板的正确结合是关键引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则 的聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可 以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度 再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高4.2 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg = 10-12）量级的起始待测模板扩增到微 克（pg=-6）水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个 RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌4.3简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴 锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4小时完成扩增反应扩增产物一般用电泳分析，不一 定要用同位素，无放射性污染、易推广4.4 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床 标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测5 PCR常见问题5.1假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净， 特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚⑤模板核酸变性不彻底 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病， 因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假 阴性需注意的是有时忘加Ta q酶或溴乙锭引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、 容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造 成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位②引物的浓度不仅要看OD值， 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致， 如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如 一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度③引物应高浓度小量分装保存，防止 多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效④引物设计不合理，如引物长度不够， 引物之间形成二聚体等Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大浓度过高可降低PCR扩增的特异性， 浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大 体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积 时，一定要模索条件，否则容易失败物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴 性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而 降低PCR扩增效率有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和 延伸温度，这也是PCR失败的原因之一靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失 使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

5.2 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩 增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性需重新设计引物靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染， 导致假阳性这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅 出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头 等均应一次性使用必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸二是 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性可互相拼接，与引物互补 后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除5.3 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特 异性扩增带非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二 聚体二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量， 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性 扩增其对策有：必要时重新设计引 物减低酶量或调换另一来源的酶降低引物量，适当增加 模板量，减少循环次数适当提高退火温度或采用二温度点法（93弋变性，65弋左右退火与延伸5.4出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差， dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起其对策有：减少酶量，或 调换另一来源的酶②减少dNTP的浓度适当降低Mg2+浓度增加模板量，减少循环次数原位PCR在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的 发展纵观形态研究领域，50 年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞 水平的深入研究；60-70 年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由 亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位， 对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响70 年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用， 随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又 提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深 化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR――多聚酶链反应技术问世了， 很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位 及观察。

这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步 1基本原理原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从 而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下 的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106 倍），很容易在凝胶电泳或 Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自 动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增 前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系 起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结。