骨质疏松性骨折的小鼠模型探索.docx

骨质疏松性骨折的小鼠模型探究李伟龙;余霄;毛宾尧;庞清江【摘要】ObjectiveToestablishasimpleandreproducibleosteoporoticfracturemodelinmice.MethodsFifty12-weekC57BL/6Jfemalemicewererandomlydividedintocontrolgroup(n=10),shamgroup(n=20)andmodelgroup(n=20).Miceincontrolgroupweresacrificedafteroneweekandtheserumestrogenlevelsweremeasured.Miceinmodelgroupunderwentbilateralovariectomy,whileshamoperationwasgiventomiceinshamgroup.Onemonthafteroperation,theleftfemurwasexposedbylateralincisiononleftthighofmice,intramedularynailingwasperformedfromkneejointforinternalfixation,thelowermiddle1/3sectionofthefemurwasseveredunderdirectvisiontomakeatransverseorshortobliquefractureofthefemur.Attheweek2and4afteroperation,themiceinbothgroupsweresacrificedinbatches(n=10foreach),serumestrogenlevelsweremeasured,bonemineraldensity(BMD)wasdeterminedandthecalluswereexaminedwithMicro-CT.ResultsTheserumestrogenlevelsinmodelgroupwerelowerthanthoseinshamgroupatweek2and4afteroperation(bothPv0.05).ThereweresignificantdifferencesinBMD,bonevolumeandrelativevolumefractionbetweenshamgroupandmodelgroupatweek2and4afteroperation(allPv0.05).Trabeculaseparationwassignificantlyhigherinmodelgroupthanthatinshamgroupatweek4aftersurgery(Pv0.05),whiletherewasnosignificantdifferenceinweek2(P>0.05).Therewasnosignificantdifferenceinstructuremodelindexbetweenthetwogroups(P>0.05).ConclusionOvariectomyandintramedullarynailingisasimple,intuitionalandstablemethodforestablishingaopenosteoporoticfemurfracturemodelinmice,whichmaybeusedinlaboratorystudyforpostmenopausalosteoporoticfractureandbonemetabolism.%目的建立操作简洁、重复性好的骨质疏松性骨折小鼠动物模型,以用于中老年女性绝经后骨质疏松性骨折愈合状况的争论.方法选取12周龄健康的C57BL/6J雌性小鼠50只，其中基线组10只,去势组20只，假手术组20只•常规饲养1周后,处死基线组小鼠并测量血清雌激素水平,去势组小鼠通过腹正中切口行双侧卵巢切除,假手术组小鼠切除双侧卵巢四周等量的脂肪组织.去势后4周对小鼠的左大腿行后外侧切口,暴露股骨,从膝关节处逆行插入钢针进行髓内固定,直视下用手术刀切断股骨中下1/3段部分,造成股骨的横行或斜行骨折.两组小鼠在骨折术后2周和4周分别处死10只测量血清雌激素水平、骨痂处骨密度(BMD)及Micro-CT状况.结果术后2周和4周假手术组雌激素浓度均高于去势组，差异均有统计学意义(均Pv0.05).术后2周和4周假手术组和去势组BMD、骨体积、骨体积分数比较,差异均有统计学意义(均Pv0.05)•虽然术后2周假手术组和去势组骨小梁分别度(Tb.Sp)比较差异无统计学意义(P>0.05),但术后4周两组Tb.Sp比较差异有统计学意义(Pv0.05),而术后2周和4周两组骨小梁结构模型指数比较差异均无统计学意义(均P>0.05).结论小鼠骨质疏松性骨折模型具有操作简洁、直观稳定等优点;去势后的小鼠成骨力气明显下降,可用于原发性绝经后骨质疏松性骨折的愈合及其骨代谢的细胞、分子及信号通路的机制争论.【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2022(039)016【总页数】4页(P1320-1323)关键词】雌性小鼠;去势;骨质疏松性骨折;动物模型【作者】李伟龙;余霄;毛宾尧;庞清江【作者单位】315211宁波高校医学院;宁波市其次医院骨科中心;宁波市第一医院骨科;宁波市其次医院骨科中心【正文语种】中文原发性骨质疏松以绝经后妇女最多见，常导致骨量严峻丢失，而其引起的骨质疏松性骨折严峻影响中老年人的生活质量，增加了家庭和社会的经济负担。

绝经后骨质疏松以雌激素水平明显下降为特点，影响骨的吸取及转化，并增加骨折的风险［1］近年来，许多学科开展了雌性小鼠去除双侧卵巢建立骨质疏松动物模型的争论，并不断探究在骨质疏松模型基础上制作简洁有效的骨折模型［2］有学者设计了一种闭合性小鼠股骨骨折模型［3-4］，但是该种造模方法需要特地的骨折造模架，试验操作比较简洁又有学者提出在直视下造成雄性小鼠股骨骨折模型后再行髓内固定［5］，但是该内固定方式能否在确定的观看时间段内维持有效的固定强度还有待考证本争论将雌性小鼠去除卵巢后制作股骨骨质疏松性骨折模型，观看并评价造模效果，并行髓内固定，以模拟中老年女性绝经后骨质疏松性骨折的愈合状况1.1试验动物与分组选取12周龄健康C57BL/6J雌性小鼠50只，平均重量19~20g，购自广州动物试验中心合笼饲养1周，13周龄时随机选择10只作为基线组对比，其余40只随机分为去势组20只和假手术组20只1.2动物模型的建立骨质疏松模型的建立去势组小鼠异氟烷气体(300ml/min)吸入麻醉后，常规备皮，皮肤消毒，于腹部正中线剪开约为1.5cm，暴露双侧输卵管及卵巢，并将输卵管的卵巢侧结扎，去除卵巢及结扎的输卵管，术毕缝合伤口，并于术后连续3d腹腔注射青霉素。

假手术组小鼠仅切除双侧卵巢四周等量的脂肪组织，术毕缝合伤口，并于术后连续3d腹腔注射青霉素术后将切除的卵巢组织进行包埋和切片并行HE染色异氟烷、青霉素及染色所用试剂均由南方医科高校脊柱脊髓损伤试验室供应1.2.2股骨骨折模型的建立将去势组和假手术组小鼠常规饲养4周后，相同方法麻醉，左侧大腿备皮，皮肤消毒，参考相关文献［3-5］，于左大腿后外侧作切口，钝性分别肌肉及软组织，暴露股骨，从膝关节处逆行插入直径为0.45mm的钢针进行髓内固定，直视下用手术刀切断股骨中下1/3处，造成横行或斜行骨折（横行或短斜行骨折35只，长斜行骨折5只）术毕缝合切口术后连续3d腹腔注射青霉素，定时观看伤口愈合状况，全部小鼠均未发生感染，切口愈合良好1.3血清指标检测将基线组小鼠在13周龄时处死取血，去势组和假手术组小鼠建模后2周和4周分别处死10只取血（均用眼球取血法）接受ELISA法检测小鼠血清中雌激素水平，试剂盒购自广州维博鑫生物科技有限公司（950035048，96T/48T）1.4骨痂处骨密度（bonemineraldensity，BMD）检测和Micro-CT检查将建模后2周和4周处死的小鼠左侧股骨分别，当心剥离四周的软组织及肌肉，并拔除钢针，将整段股骨浸泡在10%甲醛溶液中48h后取出放在70%乙醇中4工保存，取左侧股骨进行Micro-CT（skyscan1176,Bruker,美国）检查。

股骨用潮湿的纸巾包裹，放入样本扫描固定器中，确保股骨长轴和扫描器长轴全都扫描参数设定：选定全部骨痂区域，50kV,98pA,每层厚度9pm,扫描结束后运用Micro-CT自带软件进行BMD、术后X线片、CT等数据分析其中BMD是最直观反映骨质疏松程度的指标，也是临床最常用的指标骨体积（BV）代表骨小梁本身的体积，骨体积分数（BV/TV）代表骨小梁体积占骨组织体积的百分比，这两个值越大，代表骨量越多，是反映骨量多少的重要指标骨小梁分别度（Tb.Sp）是指骨小梁之间的髓腔平均宽度，Tb.Sp的增加，提示骨吸取增加，可能发生骨质疏松结构模型指数(SMI)是定义骨小梁板状和杆状的程度，SMI数值越高，代表骨小梁从板状向杆状转变，表明发生了骨质疏松1.5统计学处理接受SPSS20.0统计软件计量资料以表示，组间比较接受两独立样本t检验PvO.05为差异有统计学意义2.1两组小鼠雌激素水平比较术后2周，假手术组雌激素水平为(41.59±2.51)pg/ml，高于去势组的(37.12士2.40)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)术后4周，假手术组雌激素水平为(40.28±1.90)pg/ml，高于去势组的(29.74±3.07)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2两组小鼠不同时点BMD比较术后2周去势组小鼠BMD较假手术组明显下降，而到了术后4周，去势组和假手术组的差距更加明显，两组小鼠不同时点BMD比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表12.3两组小鼠不同时点Micro-CT数据比较及术后X线片检查假手术组和去势组BV、BV/TV均有明显下降，两组术后2周和4周比较差异均有统计学意义(均P<0.05)虽然术后2周假手术组和去势组Tb.Sp比较差异无统计学意义(P>0.05)，但术后4周去势组Tb.Sp达到了(0.6000±0.0253)pm,相对于假手术组的(0.5064±0.0297)pm,差异有统计学意义(P<0.05)，而两组术后2周和4周SMI比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2术后在分别股骨及去除髓内针时均无明显内固定松动图2为术后4周去势组小鼠的股骨在去除髓内钉后的X线片，可见骨折线为横行骨折，而其余股骨的骨折形态也均为横行或斜行骨折女性原发性骨质疏松与绝经后雌激素的下降明显相关随着女性年龄的增长，雌激素水平不断下降，刺激成骨细胞的作用减弱，骨吸取作用增加，骨量严峻丢失［6-7］近年来，许多学科开展了雌性小鼠去除双侧卵巢建立骨质疏松动物模型的争论，并不断探究在骨质疏松模型基础上制作简洁有效的骨折模型［2］。

本试验从卵巢病理切片确认了操作的精确     性，从血清雌激素水平的下降确认了骨质疏松模型的建立成功大鼠和小鼠的骨折模型在基础试验中已经广泛运用［8-9］，上世纪80年月已有学者报道大鼠的闭合股骨骨折模型，可重复性好［10］王希强等［11］曾提出徒手折骨造成大鼠股骨骨折，但是这对操作者的试验操作要求较高，制造成横形或斜形骨折的可重复性差Marturano等［3］和张志公正［4］在其他学者建立的小鼠股骨骨折模型的基础上设计了一种闭合性小鼠股骨骨折的模型虽然该两种方法可重复性好，形成横形骨折模型的比例高，但该种造模方法需要特地的打击器具，试验操作比较繁琐Furuta等［7］则使用髓内固定，然后用线锯造成横行骨折，因此也有学者将此应用到小鼠股骨骨折的模型制作中，但该种方法仅在雄性小鼠中被证。