红花黄酮类成分累积量与功能基因表达水平的关联分析.doc

红花黄酮类成分累积量与功能基因表达水平的关联分析[摘要]记录并计算红花开花 1～7 d 的平均产量，采用 HPLC检测红花中羟基红花黄色素 A（HYSA） 、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量，使用 Realtime PCR 检测 chs，chi 的相对表达量，并进行相关性分析红花平均产量、HYSA 和柚皮素的含量及基因表达量之间呈现相似的变化趋势平均产量于开花第 3 天达到最大值，与 HYSA含量存在较高正相关性（r=0756，P[关键词]红花； 黄酮类成分； 平均产量； 功能基因； chs； chi 红花为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L 的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干[1]，是临床常用的活血化瘀要药据统计， 《中国药典》2015 年版收载含红花的中成药达近百种目前红花主产于新疆准噶尔盆地边缘、伊犁河谷地带，年产量达27×104～36×104 t，占全国红花种植面积和总产量的 80%左右 羟基红花黄色素 A（hydroxysafflor yellow A，HSYA） 、槲皮素（quercetin） 、柚皮素（naringenin）和山柰酚（kaempferol）均为红花中的黄酮类成分，是活血化瘀的主要有效成分。

黄酮类成分合成途径可分为 2 个阶段：第一阶段通过莽草酸途径和乙酸丙二酸途径合成黄酮类基本骨架前体物质――4 香豆酰辅酶A（4coumaroylCoA）及丙二酰辅酶 A（malonylCoA） 第二阶段是黄酮类代谢的关键步骤，即 1 分子 4 香豆酰辅酶 A 及 3 分子丙二酰辅酶 A 在各类酶的作用下形成醌式查尔酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物查尔酮合成酶（chalconesynthase，CHS）是红花黄酮类成分生物合成途径的第一个关键酶，可形成具有 C13 架的黄酮类化合物――查尔酮，可作为中间产物进一步转化构成醌式查尔酮类和柚皮素[2]查尔酮异构酶（chalconeflavononeisomerase，CHI）是红花黄酮类成分生物合成途径分支上的第一个关键酶[3]，可催化分子内的环化反应，使查尔酮类结构异构形成柚皮素，继而在各类酶的作用下形成二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物[4]chs 与 chi 分别在灯盏花、桑、决明等的研究中证明为黄酮类成分合成途径中的关键酶基因 因此，本研究对开花 1～7 d 的红花进行平均产量、黄酮类成分动态累积量及功能基因相对表达量的检测，并进行关联性分析，为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，同时也为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。

1 材料 红花种子来源于四川省农业科学院――简阳市石盘镇中药材资源基地，种植于成都中医药大学药用植物园内，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为菊科植物红花 C inctorius 于 2015 年 1 月 24 日播种，2015 年 5 月 31 日开花于开花 1～7 d 每日上午 8：00 采摘，清洁并吸干水分后置冻存管内，立即放入液氮中速冻，带回实验室，一部分直接提取 RNA，质量合格者反转录成 cDNA，置-20 ℃冰箱中备用；一部分低温冷冻干燥 24 h，IKA 液氮打粉机粉碎，用于含量测定 色谱纯乙腈、甲醇（美国 Fisher 公司） ；分析纯磷酸（成都市科龙化工试剂厂） ；超纯水（自制） ；羟基红花黄色素 A 对照品（批号 MUST15072815，成都曼斯特生物科技有限公司） ；Agilent 1200高效液相色谱仪（包括化学工作站） 、Agilent 1260 DAD 紫外检测器（美国 Agilent Technologies 公司） ；电子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司） ；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司） ；2×Taq PCR Master Mix、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂（天根生化科技有限公司） ；荧光定量 PCR 仪（美国 BioRad 公司） 。

2 方法 21 红花平均产量计算 采摘开花 1～7 d 整个花序的管状花，随机取 50 朵长度 15 cm左右的管状花，清洁并吸干水分后称重（M） ；随机标记 10 个花序，于开花 1～7 d 每日对开放管状花进行计数，计算平均值（N） 计算红花平均产量（开花 1～7 d 每个花序管状花的平均质量）=M?N/50 22HPLC 测定黄酮类成分含量 221HYSA 含量测定[5] 精密称取红花粉末 04 g，精密量取 25%甲醇 50 mL，称量，25 ℃超声（300 W，50 kHz）处理 40 min，取出后称重并补足失重用 045 μm 滤膜过滤得供试品溶液Agilent Zorbax Eclipse XDBC18 色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm） ；以甲醇乙腈 07%磷酸溶液（26∶2∶72）为流动相，等度洗脱；检测波长 403 nm；流速 08 mL?min-1；柱温 25 ℃；进样量 10 μL 222 槲皮素、柚皮素和山柰酚含量测定精密称取红花粉末 10 g，精密量取甲醇 25 mL，95 ℃回流 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液 15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液（取 15～37 mL）5 mL，摇匀，置水浴中加热水解 30 min，立即冷却，转移至 25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm） ；以甲醇 04%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长 360，254 nm；流速 10 mL?min-1；柱?? 25 ℃；进样量 20 μL 23chs 基因表达分析[6] 查阅文献[3]，得到红花 chs（上游引物 5′GTCGTCCTCTTCGTTGTGGT3′；下游引物5′CAAAGGCGAAAAGACGATTC3′）和内参基因 25s（上游引物5′GGAGGTTGAGGGAAAAGGAG3′，下游引物5′GTGACCTCGTCACCCGTAGT3′）的 Realtime PCR 引物序列扩增体系 10 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，5 μL；上游引物 05 μL；下游引物 05 μL；cDNA 模板，1 μL；ddH2O，3 μL考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察 Realtime PCR 条件（退火温度以 50～65 ℃梯度考察）：94 ℃，3 min；30 个循环（94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min） ；72 ℃ 5 min。

确定条件并测定红花 chs 和内参基因 25s 的表达量 　　24chi 基因表达分析[5] 查阅文献[7]，得到内参基因 Ct60s（上游引物5′CATCCATTATCCAACAATC3′，下游引物5′AAGAGTAATCAGTCTCCA3′）的 Realtime PCR 引物序列扩增体系20 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，10 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL；cDNA 模板 5 μL；dd H2O 3 μL考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察 Realtime PCR 条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；Plate Read（52～60 ℃，30 s） ，40 个循环；95 ℃ 30 s；Plate Read（65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s） 确定条件并测定红花 chi 和内参基因 Ct60s 的表达量 25 数据分析利用 BioRad CFX Manager 软件分析 chs 及 chi 的相对表达量然后，利用 SPSS 170 统计学软件进行分析，考察平均产量、有效成分动态积累及基因表达水平之间的相关性 3 结果 31 红花平均产量的计算对红花开花 1～7 d 的花序形态进行记录、描述，并对平均产量进行计算，结果见图 1，表 1。

红花开花1～7 d 管状花依次开放，3～4 d 开放完全，并于 5～7 d 逐渐枯萎，颜色由浅黄逐渐加深为橘红由表 1 可知，红花平均产量逐渐增大，于第 3 天达到最大值，后逐渐减小 含量呈现相似的变化趋势，均在 1～3，4 d（始花期至盛花期）逐渐增加至最大值，在 3，4～7 d（盛花期至衰败期）逐渐降低将红花平均产量与 HYSA 含量进行相关性分析可知，两者存在较高正相关性（r=0756，P。