罗氏TUNEL使用说明书(中文)[实用].pdf

罗氏公司罗氏公司 TUNELTUNEL 细胞凋亡检测程细胞凋亡检测程序序 （（In situ cell death detection kitIn situ cell death detection kit- -PODPOD 法法）） 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测 试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情 况其原理是荧光素（fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸 末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联 苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色） ，特异准确地定位 正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常 的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3-OH 形成，很少 能够被染色 本试剂盒适用于组织样本 （石蜡包埋、 冰冻和超薄切片） 和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用 于抗肿瘤药的药效评价， 以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶 段 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒 与纱布） 、 塑料盖玻片或封口膜、 吸管、 各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含 TdT 10、荧光素标记的 dUTP 1、标记荧光 素抗体的 HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、 95、90、80、70） 、DAB 工作液（临用前配制，5 l 20DAB1L 1 / 4 30H2O294 l PBS） 、Proteinase K 工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制） 、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透加 TUNEL 反应液加 converter-POD与底物 DAB 反应显色光学显微镜计数 并拍照。

具体操作步骤： 1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min； 2.用梯度乙醇 （100、 95、 90、 80、 70） 各浸洗 1 次， 每次 3min； 3.PBS 漂洗 2 次； 4.用 Proteinase K 工作液处理组织 15-30 min 在 2137C （温 度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液 8min； 5.PBS 漂洗 2 次； 6.制备 TUNEL 反应混合液，处理组用 50l TdT450l 荧光 素标记的 dUTP 液混匀； 而阴性对照组仅加 50l 荧光素标记的 dUTP 液，阳性对照组先加入 100l DNase 1，反应在 152510min， 后面步骤同处理组 7.玻片干后， 加 50l TUNEL 反应混合液 （阴性对照组仅加 50l 荧光素标记的 dUTP 液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反 2 / 4 应 371h 8.PBS 漂洗 3 次； 9.可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞 （激发光波长为 450500nm，检测波长为 515565nm） ； 10.玻片干后加 50l converter-POD 于标本上，加盖玻片或封口膜 在暗湿盒中反应 3730min。

11.PBS 漂洗 3 次； 12.在组织处加 50100lDAB 底物，反应 152510min； 13.PBS 漂洗 3 次； 14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染， 几秒后立即用自来水冲洗 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片 15.加一滴 PBS 或甘油在视野下， 用光学显微镜观察凋亡细胞 （共 计 200500 个细胞）并拍照可结合凋亡细胞形态特征来综合判断 （未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体， 贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘 化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体） 四、注意事项 1.进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 min 2.PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液 后再进行下一步反应 3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后， 请盖上盖玻片或保 鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又 3 / 4 可以防止反应液干燥造成实验失败 4.TUNEL反应液临用前配制， 短时间在冰上保存 不宜长期保存， 长期保存会导酶活性的失活 5.如果 20DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新 配制。

6.用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于 0.1M 醋 酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿然后 进行洗净（100%乙醇)、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微 镜观察操作如果此时使用 8090%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易 脱色，注意快速进行脱水操作 7.荧光素标记的 dUTP 液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通 过吸入、口服等途径进入机体，注意防护 8.试剂保存；未打开的试剂盒贮存在20（1525） ； converter -POD 液一旦解冻，以后就保存在 4（28）下，至少 在 6 m 内稳定，避免再次冻存；TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰 上直至使用 9.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组 织细胞中可产生大量 DNA 片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的 凋亡性细胞死亡缺乏 DNA 断裂或 DNA 裂解不完全， 以及细胞外的矩阵 成分阻止 TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果 4 / 4 。