酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定教程文件.ppt

酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定【实验目的】【实验原理】1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定酵母RNA含量的原理和方法 酵母核酸中RNA含量较多RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在 RNA含量测定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常用地衣酚法测定其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物1.实验材料： 酵母粉(或酵母片)【实验材料和主要仪器、试剂】2.实验仪器： 研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计3.实验试剂：0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地衣酚-铜离子试剂【实验材料和主要仪器、试剂】【操作步骤】 1.RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。

将悬浮液转移至100毫升锥形瓶中在沸水浴上加热30分钟后，冷却离心(3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙醇溶液中注意要一边搅拌一边缓缓倾入待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟弃去清液用95乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤沉淀可在空气中干燥 2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定3.RNA的组分鉴定（1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成3.RNA的组分鉴定（2）核糖 取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL放沸水浴中10分钟注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在3）磷酸 取1支试管，加入1ml水解液，加入5滴浓HNO3和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否存在4.RNA地衣酚法显色测定（1)标准曲线的制作（1)标准曲线的制作按上表编号及加入试剂加毕，摇匀，置沸水浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号管作对照,于670nm波长处测定各管光吸收值。

取测定的平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线2)样品的测定取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行测定.(3)RNA含量的计算根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，计算出制品中RNA的百分含量注意事项】u样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定u本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用如在试剂中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分反应2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收u定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效因此可以改用钼酸铵试剂定磷核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀思考题】1、如何得到高产量RNA粗制品？2、验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱氧核糖，为什么？3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂：FeC136H2O,CuC12H2O和CuO,哪种催化剂的催化效果更好？4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪些 如何能减少它们的影响。