大肠杆菌实际步骤.docx

基因公司NucleoBond@Xtra Midi/Maxi质粒提取试剂盒操作步骤一、 单克隆培养 3-5ml条件：37oC + 300 rpm + 8h二、 扩大培养100ml条件：37oC + 300 rpm + 12-16h，最长不超过16小时，如果时间无法 满足，在14小时时将菌液移入4oC冰箱保存，尽量早点提取三、 菌液离心：4500-6000 X g，而实际我们大的离心机只能转到1200g，离心15min打开 水浴恒温箱预热，抽取ELU 5.5ml放入15ml离心管中，水浴中加热至50oC，勿拿出， 备用，以提高洗脱效率四、 架好台架，备用五、 重悬：加入|RES+RNase函 8ml，然后吹打直到看不见团块为止六、 裂解：加入LYS 8ml，轻轻上下倒置5次，室温静置5min，实际上4min就足够了注意：使用前检查有无SDS沉淀，若有则加热30-40oC至液体澄清为止，再室温凉冷 备用七、 将滤过管拿出架好，沿滤过管中的纸管边缘加入EQU，直到整个纸虑管变湿（大概 所需为12ml）八、 中和：加入NeU 8ml，立即上下倒置10-15次，勿震！！！九、将以上液体均匀混合，上下倒置3次后移入已平衡的滤过管中，室温下静置，利用重 力待水自然滤过。

注意：一定要在移入前上下轻轻颠倒使之无凝块，有絮状为正常十、再次沿滤过管中的纸管边缘加入EQU 5ml，保证裂解液被清洗干净十一、轻轻快速颠倒滤过管，以丢弃其中的滤纸管往塑料滤过管中加入Wash! 8ml,重力自然滤过注意：枪头喷出液体打在管壁上， 不要直接往滤纸上喷射准备一个15ml离心管收集洗脱液，往滤过管中加入已预热50oC的重力自然滤过，收集洗脱液后进行下一步十二、十三、5ml注意：使用50ml的离心管，使总液体不超过离心管的2/3,有利于混匀此时液体由 浓变稀即可立即进行第八步！十四、沉淀：加入异丙醇3.5ml，分装入1.5ml tube中，分成八份后离心条件：15000 X g+ 30min + 4oC加入异丙醇后有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白以及 下层有机溶剂维持稳定十五、无水乙醇沉淀，洗脱干燥DNA团粒：加入无水乙醇2ml，即每个1.5ml tube中加入 250ul无水乙醇；离心：15000 X g + 5min +常温（18-25oC）/4oC试剂盒上用70% 乙醇，而实际采用无水乙醇，效果更好离心后，可见银白色团块沉淀于管底，用移 液枪小心吸取干净乙醇，剩下部分室温（18-25oC）干燥。

「六、加入适量TE，重悬质粒，进行混匀实际采用无核酶水|,每个小tube中加入100ul 将8个tube管中液体统一移入一个1.5ml tube中十八、测浓度，整体或分装，-20oC保存。