双荧光素酶报告基因检测系统-promega.docx

Dual-Luciferase® Reporter Assay 试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate IvialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer （PLB）, 5X 30ml1. 1X PLB:加 1 体积的5X Passive Lysis Buffer （PLB）到4体积的dH 0中，机保存（一个月） 22. LAR II： 将Luciferase Assay Substrate重悬于 10ml Luciferase Assay Buffer II中（-200保存1个月，-70oC保存1年）3. 1X Stop & Glo 试剂：1 体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-20oC保存15天）每次试验需要100ul ） 细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1乂 PLB （推荐用量）Volumes of 1X PLB to Use In Step 3.Passive Lysi§ Active Ly&isPlate Size1XPLBDis^Plate Size1X PLB6-well50如I100 x 200mm1ml12-well250pl60 x 15mmtop i24-well10叩35 x 12mm200pl48-well65pl6-W&II25印I96-well20pl12-welllOOul4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，cell L暨信Feme岫 growlh meda Ironi cell* Rins wllli IX PBS./一 1KFLB.Perloim 御s.Transler to a new tube w vial.-Dual-Luciferase^ Reporter Assay andPH OTOCfl LDual-Luciferase® Reporter 1000 Assay SystemstJEfflUCTIOIE FOfi USE OF WK0UCI5 E1310. E13EOWDE15WDual-Lucilera呻 and DuM-Liwile做砰1KM）。

Assay ProtocolAsiy Willi 56-Wain PlateBsfun youbaqinSet i nlMtns 1 atd 2 ^dlspenu 1D0|j|otLAR I did Slop & GId® Rea pent.修（溢血眦.Far measuranenis use a 1-to 2-seoond delay and』5- Io l'>5Bccnd irad Uitie.依&邳 wMh Manual ai Single-injeclir mminaieier|insidg lurnnamtiBrjPlate "I〕_20p| 匕"脚射岫1削Ispen踌Id卯I 计 UW II ntn lumlnoneter tuts.Pro-am Liiingler.DiSCelEti 100^01 LAfill.Measure I nlly luciferase aclhlty.DispeiEfl 10卯 lolSlop & GICl® 磁网LMeasure R^iUa lucifiefase activity.hleasu 矿 Irpfly luciferase 汨 iwily.曲piWfl 1 祯I al Stop & G 睛 Raagenl.mn血 r20pl of PLB L牌胡.MIX.Repeal cycle lor romatilng wNs in plale.sn'=mEI号Measure Ret艰总l此imra推 activity. 3Additfcnal praloco I informal ion is mailable in Technical Manual 打船。

ci 彻傩 available online at； www. pm ms i|3. com瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染重组质粒分别为 p-629/+100 , p-401/+100,P-238/+100，p-80/+100，p-25/+100pGL3- basic 为阴性对照；同时以转染 phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行1. 将质粒DNA(3.2pg)与phRL-tk (0.8pg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀^加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混 合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100u gHO 或 B(a)P 处理 lh 或 24h;( 200 u M MMS，24h-溶解于 Me SO, Sigma)；2 2、、、、 2(H2O2不引起OGG1升高)7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为 化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。

8. 以相对荧光素酶单位(相当于对照组的百分比)表示结果采用Student-t检 验分析各组之间荧光素酶活性的差异。