D1蛋白酶的表达和纯化及其活性测定.pdf

D1 蛋白酶的表达和纯化及其活性测定 金叶 3120100419 一、实验目的和意义 二、主要材料 三、操作方法和实验步骤 四、实验结果与分析 五、参考文献 一、一、 实验目的和意义实验目的和意义 农药在当今农业生产中占有重要的地位， 农药的使用不仅是农业增产的重要因素， 也是解决全世界 60 亿人口温饱问题的有力措施但是近年来，随着植物对农药抗性的增加，以及社会和环境对农药品种安全性的要求， 许多农药品种已经被列入禁用名单， 实际上在市场上使用的农药品种在相对地减少因此，开发高效、低毒、环境友好的新型农药显得尤为迫切 D1 蛋白是植物光合系统 II 中的一个组成亚基，起着连接电子供体和放氧复合体的作用， 它是由质体 psbA 基因编码的大小约40 kDa的膜蛋白， 在植物类囊体中以前体蛋白 （pD1）的形式表达， 需要在 D1 蛋白酶的作用下剪切掉其羧基端延伸的肽段之后成为成熟的 D1 蛋白（mD1） D1 蛋白酶是由叶绿体核 ctpA 基因编码的含有 389 个氨基酸残基的单亚基蛋白，大小约为 45 kDa，主要酶切 D1 前体蛋白中 C 端延伸的肽段,使之转变为 mD1，进一步用于光合系统 II 中锰簇合物的组装,具有维持光合系统 II 损伤-修复循环过程的重要作用，该酶切过程是植物进行光合作用必不可少的步骤。

集胞蓝细菌 Synechocystis sp 和斜生栅藻 Scenedesmus obliquus 在 ctpA 基因敲除后均呈现出非光合自养的表型，证实 D1 蛋白酶也是植物光合作用链中的重要组成部分， 因此 D1 蛋白酶被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标由于 D1 蛋白酶在植物中的含量只有 D1 蛋白的 1%左右，与当前广泛使用的以抑制 D1 蛋白为靶标的除草剂 (如西玛津、阿拉特津、敌草隆等)相比，开发以 D1 蛋白酶作为靶标的除草剂将会使得农药的施用量大幅度减少， 对环境和人类的毒副作用也将会大为降低，可望成为新一代的农药品种 二、二、 主要材料主要材料 菠菜等时令蔬菜； 大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3） 、表达载体、克隆载体、DNA 限制性内切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶、PCR、电泳相关等材料 三、三、 方法方法 （1） D1 蛋白酶的表达与纯化 1、 总 RNA 的提取和 cDNA 的合成 从所选择的蔬菜中提取总 RNA，取微量用电泳检测所提 RNA 的完整性按照 cDNA 合成试剂盒说明，先合成 cDNA 第一链，再合成 cDNA 第二链，最后对合成的 cDNA 进行精制，取适量微量合成的 cDNA 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后−20°C 保存。

2、 PCR 引物设计、合成与 PCR 扩增 根据 GenBank 中获得的CtpA 基因序列 (Accession No. D50585)，设计了一对引物，序列如下：CtpA-1:5′-GAGAGCTAGCCTTTCTGAGGAGA ATCGA-3′，其中下划线部分为限制性内切酶 Nhe I 的识别序列；CtpA-2:5′-GTGTCTCGAGTCTTGAGA AAAGAGTTGTAC-3′，其中下划线部分为限制性内切酶 Xho I 的识别序列以合成的 cDNA 为模板，CtpA-1、CtpA-2 为引物，扩增CtpA目的基因 3、 克隆载体 pMD18-T-CtpA 的构建及序列测定 按照试剂盒说明书要求， 取 2μL 回收后的CtpA基因与 1μLpMD18-T 载体连接， 并转化至大肠杆菌 DH5α 中，通过蓝白斑筛选后扩大培养，采用限制性内切酶 Nhe I 和Xho I 酶切重组质粒 pMD18-T-CtpA，同时进行 PCR 扩增鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳分析将鉴定结果正确的阳性菌和质粒进行测序 4、 表达载体pET-28a-CtpA的构建及鉴定 用限制性内切酶将CtpA基因从重组质粒pMD18-T-CtpA上切下， 再用同样的限制性内切酶酶切质粒 pET-28a，将 CtpA 片段和 pET-28a 酶切产物用 1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，再取 4 μL CtpA 基因与 2 μL 载体 pET-28a，用约 1μLT4 DNA 连接酶（350 U/μL）于 16°C 连接过夜， 连接后的产物转化至大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞， 接种于含 50mg/mL 卡那霉素的 LB 平板上培养，采用碱裂解法提取质粒 DNA，用限制性内切酶Nhe I 和Xho I 酶切重组质粒 pET-28a-CtpA，同时以该质粒为模板，合成的 CtpA-1 和 CtpA-2 为引物进行 PCR扩增，酶切和 PCR 扩增后的产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，确保目的基因片段和表达载体连接正确，表达载体构建成功。

5、 CtpA 的诱导表达及纯化 Dl 蛋白酶的表达和纯化参照文献方法 将含有pET-28a-CtpA的 BL21(DE3)感受态细胞转入至含有 Kana 的 LB 培养液中，37℃振荡培养过夜，次日按照 1:100 的比例接种至新配制的 LB 培养液中，在 37°C、250 r/min继续振荡培养至A600为0.8左右， 加入IPTG 至终浓度为 0.1 mmol/L， 然后在 8°C、 250 r/min 继续振荡培养 72h诱导后的菌液在 4°C、8000 r/min 离心 20 min，收集菌体按照每克湿菌体加入 10 mL 柱平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl)的量充分悬浮菌体，在冰浴条件下超声破碎菌体 (300W,工作 5s,间歇 3s,共 99 次),然后 4°C、 12 000 r/min 离心 40 min，分离上清液和沉淀将上清液加至预先用平衡缓冲液充分平衡好的 Ni-NTA 亲和层析柱 (1 mL),并用平衡缓冲液淋洗 10 个柱体积,然后换用含不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱 CtpA 蛋白，收集各组分，并将各组分进行 12% SDS-PAGE 电泳分析。

采用超滤法(Millipore, 截留分子量 3000)对纯化后的蛋白进行浓缩，浓缩后的样品采用 Superdex75 凝胶过滤层析柱(HiLoad16/60,GE)进一步纯化，采用缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl)洗脱，流速为 1.0 mL/min，通过 280 nm 处的光吸收进行检测，收集各组分，12%SDS-PAGE 电泳分析蛋白浓度采用 BCA 法测定 （2） D1 蛋白酶的活性测定 纯化后的 D1 蛋白酶活性测定以合成的 D1 蛋白前体羧基端 24 肽作为模拟底物，采用高效液相色谱检测系统和反相柱对水解产物进行分离和检测 取 21μL D1 蛋白酶(0.657 mg/mL) 和 3 μL 底物 P-24(5 mmol/L)加入至 1.5 mL EP 管中,并用缓冲液补足至 73μL，25°C恒温反应 6 h 后加入 27μL TFA (0.1 mol/L)中止反应10 000 r/min 离心 10 min，取 20 μL 上清液进行高效液相色谱测定 四、四、 实验结果实验结果 为了对合成的抑制剂先导化合物进行活性评价和筛选， 需要进行必要的酶活性分析。

本实验通过优化表达， 获得了具有较高生物活性的重组蛋白酶并为下一步的抑制剂先导化合物筛选以及化合物与酶蛋白的作用机理研究提供了必要的基础 五、五、 参考文献参考文献 【1】 李慧等，D1 蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备[J] .生物工程学报 2010,4,25; 26(4): 495−502 【2】 李谦，生物药物的研究与发展策略[J].中国天然药物 2006,4:251 一 256 【3】 梨江等，D1 蛋白酶的分离纯化及其与抑制剂先导化合物的相互作用.华中师范大学学报，2008 。