植物体内沉默基因的表达.doc

激活微生物体内隐藏天然产物的生物合成激活微生物体内隐藏天然产物的生物合成Kirstin Scherlach and Christian HertweckTranslated from The Royal Society of Chemistry 2009.7摘要：摘要：微生物体产生的天然产物是新型药物的重要资源，但在标准实验室条件下培养微生物时，仍未发现更多由沉默基因编码的有价值化合物，在特殊条件， 能激这些活隐藏基因或沉默基因本文综述了采用生物合成途径激活合成隐藏 天然产物的途径，包括外部条件诱导、共培养及基因组方法，如基因组挖掘、 表观遗传修饰及工程途径激活引言引言 天然产物药物在各种疾病的治疗中一直发挥着重要作用，次级代谢产物是 新型治疗剂和药物先锋，尤其是作为免疫抑制剂，或应用于对癌症、传染性疾 病及脂肪代谢紊乱的治疗天然产物是调节病原菌的毒性因子和解释生物学靶 标的重要工具，源于自然界的天然产物的特点是它们多样的独特结构，说明它 们的开发潜能、选择性及固有的绑定蛋白质折叠特性开发微生物天然产物的常用传统方法包括采样、培养菌株、提取、活性筛 选及结构确定，这些方法常因为较高的重复率而失败。

但对微生物基因组的不 断研究为天然产物生物合成的原理提供了宝贵依据，同时为发现和合成新型化 合物提供了很好的供选方案在微生物体内，编码次级代谢产物生物合成的基 因是成簇的，这个发现利于后续研究且已对控制两大类天然产物生物合成的 PKS和NRPS途径进行了深入研究 近来基因组测序工程已发现采用传统开发方法，微生物体的生物合成潜力有待大力开发，实际上在各种细菌和真菌中，编码生物合成酶的基因组数量已 明显超过了生物体已知的次级代谢产物，其中一个原因可能是仅表达了编码生 物合成酶的少部分基因 ，因此只产生少数化学结构，这些沉默基因以“隐藏的” 或“孤立的”的方式存在，需通过诱变来激活假定的编码潜在生物活性结构的 基因但并不是所有沉默基因都是必须的，由于产率低、大量的代谢背景及不 利的培养条件等原因，导致仍未发现相应的代谢产物因此，微生物次级代谢 基因组的系统研究可能代表着向微生物体天然生物合成能力探索的第一步一一 改变培养条件、外部刺激及渗透压来开发微生物资源改变培养条件、外部刺激及渗透压来开发微生物资源 我们已经知道在发酵学发展的初期，对微生物刺激代谢产物的数量起关键 作用的是培养限制性因素，即便是培养基的微小变化，不仅会影响到某种化合 物的数量，且会影响到微生物体产生一般代谢产物的范围（如图1） 。

尤其是在 抗生素领域，已在生产率和产物范围的最优化方面做了很多研究控制营养和 环境因素能促进次级代谢产物的生物合成，也利于新型天然产物的发现Zeeck 和他的同事们已阐述了提高微生物代谢产物的发酵参数，并为此方法创造出专业术语“OSMAC”（一株菌株多种化合物的意思） 通过改变易受影响的培养参 数，例如培养基组分、通风状况、温度及培养皿的形状等，上述参数的改变可 能在真菌和放线菌中筛选到新型天然产物现有研究已发现此菌株在传统培养 条件下仅能产生一种酮类化合物，但在不同培养条件下培养赭曲霉菌株，结果 产生了15种天然产物Fig. 1 Influence of culture conditions, external (chemical) cues, and stress on natural product biosynthesis. Paranagama等采用类似方法研究两种植物共生菌的次级代谢产物，在制备 培养基时用蒸馏水代替自来水，即诱导产生了6种新的代谢产物；培养毛壳菌属 菌株时，将固体培养基变为液体培养基，代谢产物由根赤壳菌素7变为毛壳色菌 素 A 8培养条件、外部化学诱导 及渗透压因子对天然产物 生物合成的影响；这些影 响因子激活沉默基因，使 其表达出新型代谢产物。

同时对影响次级代谢产物生物合成的各种培养条件和压力条件的变化进行 了深入研究由产生球番石榴素的球壳孢菌经紫外诱变得到的菌株真菌F24 201y，在肉汤培养基中化学筛选时，发现了14个大环内酯类化合物三环唑是 DHN生物合成抑制剂，能抑制球壳孢菌素的产生此真菌在补充有三环唑的培养 基中培养时，仍会产生相同的化合物结果表明：酶抑制剂会影响生物合成途 径的激活 Ayer等人在几年前报道了杰多霉素B 10的分离，杰多霉素B 10是链霉菌 ISP5230经热激后产生的一种糖基化抗生素，37℃条件下，在含有半乳糖-异亮 氨酸的培养基中产生的代谢产物是含有糖苷配基的杰多霉素；当温度升至42℃ 时，代谢产物是杰多霉素B后续实验揭示了更一步的影响参数，正如乙醇处理 和噬菌体侵染，短时间的热激能产生更多的杰多霉素B最近发现杰多霉素B是 激光激酶B的抑制剂，因此，杰多霉素B很有希望成为新型抗癌药物 Crews等向培养基中添加了药效较大的F-肌动蛋白抑制剂后，从芦笋茎枯病 菌中分离得到三种新的球毛壳菌素类似物 在实验室中缺乏微生物产生代谢产物的条件下培养微生物时，应该考虑到 微生物的特殊环境条件要求Overy等尝试模仿真菌生长的天然环境，在浸透过 的寄主组织中培养了几株死物寄生的青霉菌，结果产生了伞房花素14和伞房花 素内酯物15-18，这也许提示了在死体营养植物或病原菌环境中，这些代谢物的 影响作用。

为达到分离发酵真菌的最佳培养条件，Bill等采用小型化平行微板发酵，发 现大量真菌筛选的培养条件是多样化的，即真菌的营养库分离化合物需要提 高发酵效果，此方法应用受到生物活性初步测定的限制二二 共培养条件下的种间干扰产生新型代谢产物共培养条件下的种间干扰产生新型代谢产物 已对微生物体天然代谢产物的功能作用进行了深入研究，尤其是在微生物 群体或种间关系等复杂环境条件下次级代谢产物的研究成为热点天然产物由 生物体与环境之间的相互作用产生，特别是在同种或异种生物之间的相互影响 下，产生了大量不同的天然产物，例如信息素、捕食系统分子及共生关系的代 谢物等（如图2） 产生多种化学物质的种间干扰方法已应用于实验室Fenical 等研究了混合发酵能否产生新型代谢产物，他们将海洋生物盘多毛菌和一种未 知的且抗抗生素的海洋细菌共培养时，生物合成了一种新型苯甲酮物质盘多毛 菌素19，具有较强的抗细菌活性，能抵抗黄色葡萄球菌的新青霉素抗性和肠球 菌的万古霉素抗性，但当两菌株单独培养时，不能得到此活性物质 Fenical 等发现在竞争性共培养条件下培养的海洋微生物埃默里克菌株，得 到两种新型缩酚酸肽产物。

嗜盐放线菌与真菌在竞争性培养条件下共培养，天 然产物埃默里克菌素A 20和B 21的产量增加了100多倍，且得到了这些化合物的 结构近来采用基因敲除方法得到了埃默里克菌素的生物合成的基因，为合成 新的结构类似物提供了依据Fig. 2 Possible routes for secondary metabolite biosynthesis in mixed cultures: (A) One organism stimulates assembly of natural products in the other organism via secretion of chemical signals or physical interaction; (B) Exchange of chemical signals: One organism induces biosynthesis of signaling molecules which then stimulate production of cryptic metabolites2006年，Angell等报道了另一种生物体协同作用产生代谢产物的事例，他 们发现在培养来自海洋底部沉积物中的混合细菌时，产生了具有抗生素活性的 蓝色染料，经X-射线、1D及2D的NMR等化学分析，得知结构与绿脓菌素22一 样是吩嗪类衍生物。

对起始混合菌中的单个细菌进行培养时，并没有产生蓝色 染料因此认为微生物间的相互作用对于刺激绿脓菌素的形成是必需的他们 通过大量实验证明微生物种间结合作用的重要性，绿脓假单胞菌和肠杆菌是混微生物体之间的 化学信号及物理 干扰激活沉默基 因表达化学信号交换：生物 体产生激活沉默基因 表达的信号分子合菌中的一对，其中绿脓假单胞菌是抗生素真正生产者，而肠杆菌为诱导菌 在几株绿脓假单胞菌中发现绿脓菌素的合成是由特定序列调控的，表明种间干 扰也涉及到小分子，使用Boyden小室的连续培养实验证明了此假设为确认生 物种间是否存在特定干扰或任何微生物都能诱导绿脓菌素的形成，将绿脓假单 胞菌与其他微生物共培养，发现另外一种肠杆菌也可作为激活体，且结果表明 分离得到的绿脓假单胞菌已经失去了自我激活产生绿脓菌素的能力，刺激信号 有肠杆菌代替提供Watanabe等通过研究吩嗪类代谢物作为氧化应激诱导剂的 作用时发现了其初级生物效应 对细菌通信系统的大量探索为新型代谢产物的研究提供了依据研究已表 明小信号分子在几种细菌产生抗生素中起着重要的调控作用，例如 A因素在灰 色链霉菌产生链霉素时是必须的，而γ-丁内酯控制维及霉素、最小霉素及防线 菌紫素的形成。

由灰色链霉菌产生的一种肽内酯霉菌素，不仅影响气生菌丝的 生长，而且抑制次级代谢产物的形成Takano等已研究了能否在实验室中利用 细菌通信系统诱导次级代谢产物的形成三三 基因组方法：从电子杂交预测到基因组方法：从电子杂交预测到基因工程方法基因工程方法 上述各种关于新型天然产物生物合成的方法在很大程度上依赖于适宜的培 养条件，即让沉默基因在实验室培养条件下表达但从全序列基因组中检测次 级代谢基因组和目前所检测到的天然产物数量之间的差异，我们可以推测大部 分基因或缺乏表达，或仍未发现相匹配的物理、化学刺激方法来激发沉默基因 的表达为充分利用资源，可尝试采用以下方法 （一）（一） 激活新型天然产物生物合成的基因激活新型天然产物生物合成的基因 将抽提文库的化学筛选方法与基因组向导方法相结合，已经成为开发新型 天然产物的有力工具，由沉默基因位点编码的假定化学结构的电子杂交预测，则能直接搜索到相关代谢物Zazopoulos等为得到合成抗癌物质的假定基因， 对几株放线菌进行了分析，最终发现适宜的培养条件能激活假定基因的表达， 产生了炔二炔类物质McAlpine等为得到I型PKS基因，扫描了放线菌基因组，预测聚酮类化合物 的紫外吸收峰为300nm。

培养条件的变化能激活目标化合物的生物合成途径在生物合成基因簇分析的帮助下得到ECO-02301 23的化学结构，并由分光镜技术 确认 对与植物共生的荧光假单胞菌属Pf-5进行分析，发现了一个沉默杂合子 PKS-NRPS基因组，且与近来发现的根瘤毒素的生物合成基因组具有高度同源性 根瘤毒素是由伯克霍尔德菌内生真菌中克隆得到，与普通想法不一样的是：毒 素是由伯克霍尔德菌内生真菌产生，而不是由真菌寄主小芽孢酒曲霉产生的 因基因簇具有同源性，已将荧光假单胞菌Pf-5生物合成根瘤毒素的能力进行了 深入研究，在各种生长条件下检测其代谢谱，产生多种结构相关联的根瘤毒素 复合物抗生素类物质来肯定其假设 基因组和分析结合的方法能发现新的真菌代谢产物为得到假定生物合成 基因簇，对巢形曲霉的全部基因组序列进行扫描，发现至少存在三个基因拷贝， 它们编码的蛋白质可能是具有高度同源性的氨基苯甲酸合酶（ASs）众所周知， 氨基苯甲酸合酶催化分支酸盐转化为氨基苯甲酸是色氨酸生物合成的关键步骤但是假定编码氨基苯甲酸合酶的基因存在大量拷贝，证实了其中一些基因的产 生可能与次级代谢途径相关联的推断氨基苯甲酸是生物碱的前体物质，尤其 是在喹啶啉、喹啉衍生物及吖啶类生物碱的合成中，研究发现巢形曲霉主要产 生了含氮的次级代谢产物，在几个检测到的培养基中发现在一含有米饭的固态 发酵培养基中产生了四种。