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上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司SIDANSAI BiotechnologyInnovator on TALEN technology and Stem Cell researchTALENTALEN技术在基因功能研究及技术在基因功能研究及ipsips领域中的应用领域中的应用靶向基因修饰What?￿ ￿￿￿￿通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能Why?￿￿￿基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段Way?￿￿￿如何基因敲除（Knockout）基因敲除的方法同源重同源重组 (Homologous Recombination)依赖DNA分子的互补性，经典基因敲除方法特点：效率低（1 per 106 cells），实验周期长 RNA干干扰 (RNA interference) 依赖RNA分子的互补性：高效性，特异性；特点：临时性，基因沉默而非敲除；锌指核糖核酸酶（锌指核糖核酸酶（ZFNZFN）） 2020世纪末世纪末DNA DNA 识别域识别域 (ZFP) (ZFP) + + 非特异性核酸内切酶构成（非特异性核酸内切酶构成（FokIFokI) )依赖依赖DNADNA识别域的识别域的特异性：效率高特异性：效率高有脱靶现象，专利被Ｓａｎｇａｍｏ垄断有脱靶现象，专利被Ｓａｎｇａｍｏ垄断基因敲除的方法TALE domain: DNA 识别域域TALE，植物病原体黄单胞菌￿Xantomonas – 用于调控宿主基因由34的氨基酸长度的重复单位构成第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同RVD决定识别位点不同Nuclease domain: DNA剪切域剪切域FokI，发现于海床黄杆菌￿Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域形成二聚体时发生剪切N’C’TALEFokILTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGNI NI → → A AHD HD → → C CNG NG → → T TNN NN → → G GA A T T T T C C T T G G C C T T A AA A C C T T C C A A T T A A C C新的里程碑技术新的里程碑技术：： TALEN (transcription activator-like effector nuclease，2010年底)TALEN切割双链切割双链5’5’3’3’左臂左臂右臂右臂FokI 聚合聚合DSBDouble strand BreakNon-homologous End Joining (NHEJ) Homologous Recombination (HR)无模板无模板有模板有模板Gene DisruptionGene insertionGene replacementForward genetics（自然突（自然突变、化学、化学诱变、插入、插入诱变等）等）RNAi同源重同源重组锌指指核酸核酸酶酶（（ZFN））TALEN突变效率低较高低低高特异性低高高高高毒性高低低高低稳定性高低高高高实验周期短短长短短 TALEN取代了过去取代了过去构建TALEN质粒如何将这些高度重复的DNA片段连接起来？TALEN的组装的组装(Golden Gate)PCR   3步步Digest  2步步Ligate  2步步一步法连接一步法连接只要只要4-5小小时，，这些片段就全部些片段就全部连接起来了接起来了一步连接一步连接123654913710121681411151718FastTALETM连接连接TALENN’C’N’C’TALEN modules at 9 positionsTALEN  backbone vectorsTALEN assembled vectorsPromoterFokIPromoterFokIx4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x16x16x4x16Position 1Position 2Position 3Position 4Position 5Position 6Position 7Position 8Position 91/21/29 x 12 dimers, 7 x 4 monomersComplete library: 172CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19Minimum RVDs: 12多种多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求骨架载体，满足不同物种需求第一组载体：干细胞干细胞专用打靶载体，采用EF1αEF1α启动子。

第二组载体：构建动物模型动物模型专用载体，含有原核表达启动子sp6sp6或或T7T7，便于体外转录第三组载体：普通细胞普通细胞打靶载体，采用CMVCMV启动子第四组载体：植物植物专用打靶载体，采用ubiqutinubiqutin或或35s35s启动子TALEN质粒构建流程质粒构建流程靶点设计靶点设计挑克隆挑克隆细菌培养细菌培养DNA质粒抽提质粒抽提酶切鉴定酶切鉴定得到测序得到测序正确质粒正确质粒TALEN连接连接细菌转化细菌转化质粒测序质粒测序Day 1Day 2Day 3Day 44 4天天得到构建正确的得到构建正确的TALENTALEN质粒！质粒！ 简单、快速！简单、快速！靶点设计靶点设计Decide TALEN target (left arm/right arm)TALE-NT2.0 https://tale-nt.cac.cornell.edu/ DNASTAR  12-19bpSpacer: 12-21bp5‘￿end ‘0’ position: must be T为了得到高活性质粒，建议设计为了得到高活性质粒，建议设计2X32X3组合。

组合Spacer 12-21bp5’5’3’3’TALEN连接连接1.设计序列，   选择模块2.加样，进行连接4-5h4-5h完成￿￿￿￿￿转化至感受态细胞￿￿￿￿￿在Kana+ LB平板中培养细菌转化细菌转化挑单克隆，挑单克隆， 细菌培养细菌培养挑 5-12 个克隆（连接效率≈50%） Kana+ LB培养液单克隆菌落单克隆菌落将单菌落接入含5ml Ka+的LB培养液的试管中DNA质粒抽提，酶切鉴定质粒抽提，酶切鉴定DNA质粒小抽提使用BamHI+PstI双酶切，植物载体采用BamHI+SpeItarget: 15 nttarget: 18 nt左臂左臂右臂右臂1kb Marker1 kb MarkerDigestionDigestionAsssembly length:15x102=1530Asssembly length:18x102=1836On backbone: 531Total length:1530+531=2061On backbone: 531Total length:1836+531=23671个单模块（由34个氨基酸—102个碱基组成）识别一个碱基上游引物:     5’-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’下游引物:     5’-AGCTGGGCCACGATTGAC-3’质粒测序质粒测序测序结果比对测序结果比对标准序列标准序列测序结果测序结果得到测序正确质粒得到测序正确质粒TALEN 的实际应用的实际应用DNADNA水平的水平的基因敲除基因敲除DNADNA水平的水平的定点插入定点插入DNADNA水平的水平的单碱基修饰单碱基修饰（点突变）（点突变）Ø建立基因敲除建立基因敲除/ /敲入的真核细胞系敲入的真核细胞系Ø建立基因敲除建立基因敲除/ /敲入的真核生物模型敲入的真核生物模型DNADNA水平的水平的miRNAmiRNA敲除敲除应用实例应用实例1 细胞模型细胞模型Hela细胞中细胞中XX基因敲除的稳转系建立：基因敲除的稳转系建立：项目执行时长项目执行时长2个月个月设计TALEN识别序列；构建TALEN载体；测序验证质粒正确性实验流程：实验流程：序列序列100%正确正确脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组DNA, 进行PCRPCR产物送测序比对测序结果，初步确认TALEN活性续上续上大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）PCR产物TA克隆、单克隆测序确定打靶效率续上续上2024/8/31最终挑选出阳性单细胞克隆，最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建扩增，保存，稳定遗传系建立成功立成功消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定部分单细胞克隆测序结果：单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。

两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系挑选至少50个单克隆测序, ，鉴定出双拷贝敲除的单克隆续上续上Knock-in 载体构建载体构建构建构建knock-in同源重组载体同源重组载体WTDonorØ提高同源重组效率提高同源重组效率Ø同源臂构建简单，同源臂构建简单，500-1000bpØ利用抗性基因快速进行筛选利用抗性基因快速进行筛选打靶示意图（基因敲入）打靶示意图（基因敲入）Dirk Hockemeyer, Haoyi Wang, Samira Kiani.Genetic engineering of human ES and iPS cells using TALE nucleases,Nat Biotechnol. ; 29(8): 731–734.打靶示意图（定点突变）打靶示意图（定点突变）Su Mi Choi, Yonghak Kim,efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells . HEP,12-2140.打靶示意图（定点缺失）打靶示意图（定点缺失）打靶效率经验参考打靶效率经验参考建立建立knock-out细胞系（双拷胞系（双拷贝敲除）：敲除）：293T，hela细胞：建系成功率成功率100%，目前成功建系19个个，打靶效率约为30 % -70%，最短耗时2个月个月ES/iPS细胞：建系成功率建系成功率100%，目前成功建系7个个，打靶效率约为20 % -50%，最短耗时4个月个月数据统计至数据统计至2013.072013.07月月打靶效率经验参考打靶效率经验参考建立建立knock-in细胞系（胞系（单拷拷贝敲入）敲入）￿ ￿：：293T、hela细胞等：建系成功率成功率100%，目前已成功建系6个个，打靶效率约为20 % -55%，最短耗时3个月个月ES/iPS细胞：建系成功率成功率100%，目前已成功建系2个个，最短耗时5.5个月个月，打靶效率约为10 % -28%数据统计至数据统计至2013.072013.07月月成功实例成功实例2 动物模型动物模型—斑马鱼斑马鱼 Zebra fish-gene AWTTALEN580bpZebrafish-geneA (Kpn I)WTTALEN580bp401bp179bpGenomic PCRRestrictive enzyme digest斑马鱼内斑马鱼内XX基因敲除基因敲除结果回馈结果回馈我方设计我方设计TALEN识别序列；识别序列；提供最终的提供最终的TALEN质粒质粒TALEN质粒线性化；体外转录显微注射一细胞期受精卵48h后收集，抽提胚胎基因组DNAPCR扩增，酶切看结果打打靶靶效效率率为为80%以以上上应用实例应用实例3 动物模型动物模型——小鼠小鼠1. 设计构建TALEN打靶载2. 细胞水平TALEN 活性检测3. 体外转录生成mRNA4. 往受精卵注射mRNA5. 得到嵌合体小鼠（F0）6. 得到F1 heterozygote 7. 得到F2 homozygote 1. 设计构建TALEN及KI donor载体2. 细胞水平TALEN活性检测基因基因敲除敲除小鼠小鼠基因基因敲入敲入小鼠小鼠3. 体外转录生成mRNA4. 往受精卵注射mRNA/DNA 混合物3. 建立ES基因敲入细胞系4. 将ES细胞系注射至囊胚5. 得到嵌合体小鼠（F0）6. 得到F1 heterozygote 7. 得到F2 homozygote 应用实例应用实例3 动物模型动物模型——小鼠小鼠PNAS. 2013 Mar; 110(10):3782-7应用 I: 基因敲除TALEN 的实际应用的实际应用Nat Biotechnol 2013 Jan; 31(1):23-4Phenotypic analysis of gene-specific knockout mice has transformed our understanding of in vivo gene functions. Generation of knockout mice, however, remains a time-consuming and expensive process. Transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs) are highly effective in inducing mutations at specific genomic loci, and consequently TALEN-mediated mutagenesis in zygotesis a potential alternative to conventional gene targeting in mice.设计构建设计构建TALENTALEN打靶载体打靶载体细胞水平细胞水平TALENTALEN活性检测活性检测体外转录生成体外转录生成mRNAmRNA往受精卵往受精卵注射注射mRNAmRNA嵌合体小鼠（嵌合体小鼠（F0F0））F1 heterozygote F1 heterozygote F2 homozygoteF2 homozygote 应用 II：基因敲入TALEN 的实际应用的实际应用The functional study of Y chromosome genes has been hindered by a lack of mouse models with specific Y chromosome mutations. We used transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated gene editing in mouse embryonic stem cells (mESCs) to produce mice with targeted gene disruptions and insertions in two Y-linked genes—Sry and Uty. TALEN-mediated gene editing is a useful tool for dissecting the biology of the Y chromosome.Nat Biotechnol 2013 Jan; 31(6):530-32利用利用TALENTALEN技术建立技术建立ESES敲除敲除/ /敲入细胞系敲入细胞系建立动物模型建立动物模型四倍体细胞补偿法验证基因表达水平验证基因表达水平应用 III: 基因定点修复TALEN 的实际应用的实际应用应用Ⅳ : DNA水平的miRNA敲除TALEN 的实际应用的实际应用思路思路1： 针对miRNA的关键识别序列”seed” sequence特异性设计一对TALEN，实现miRNA的敲除。

思路思路2: 在miRNA前体发夹结构构的的上下游上下游处分别设计一对TALEN，利用TALEN将包含发夹结构在内的DNA片段剪切致缺失，从而实现对miRNA的敲除PlOS one 8 (9), 2013(5)TALEN广泛应用广泛应用Biotechnol Bioeng. 2013 Mar 18. doi: 10.1002/bit.24890拟南芥拟南芥短兵草短兵草牛牛蟋蟀蟋蟀果蝇果蝇仓鼠仓鼠人人青鳉青鳉小鼠小鼠线虫线虫大鼠大鼠水稻水稻蚕蚕烟草烟草酵母酵母斑马鱼斑马鱼斯丹赛部分成功案例斯丹赛部分成功案例北京大学北京大学    张老师成功建立人ES细胞某基因敲除系北北京京大大学学 尹老师成功在人结肠癌细胞系以及Hela细胞系中打靶成功，打靶效率约为30%长征医院长征医院 周老师成功建立乳腺癌细胞某基因敲入细胞系清华大学清华大学    罗老师成功建立小鼠ES细胞某基因敲入系中中国国科科学学院院生生物物物物理理研研究究所所 范老师成功建立小鼠MEF细胞某基因敲除系上上海海生生化化所所   宋老师利用培训班拿到的平板直接建立仓鼠细胞某基因敲除系；细胞建系成功案例细胞建系成功案例斯丹赛部分成功案例斯丹赛部分成功案例华华东东师师范范大大学学    王老师课题组针对5个靶基因分别构建了2X3组合的TALEN质粒，目前已成功得到其中1个基因敲除的小鼠模型（打靶效率30%：10只F0代小鼠中有3只突变体）；同时另4个基因已得到经细胞水平验证后的高活性TALEN质粒，并正在后续建模中。

南南京京大大学学 官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率12.7%南方模式南方模式 费老师成功得到6个基因敲除小鼠模型华东师范大学华东师范大学    李老师成功得到某基因敲除小鼠模型 .......小鼠建模成功案例小鼠建模成功案例斯丹赛部分成功案例斯丹赛部分成功案例中中国国科科学学院院水水生生生生物物研研究究所所  肖老师成功得到斑马鱼F1代杂合子，效率为14/16，并且后续得到F2代纯合子复旦大学复旦大学   姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的F1F1代杂合体代杂合体健健康康所所     荆荆老老师师成成功功的的得得到到了了斑斑马马鱼鱼突突变变体体，，打打靶靶效效率率达达20%20%；；华中科技大学华中科技大学  刘老师成功得到斑马鱼某基因敲除的突变体；斑马鱼建模成功案例斑马鱼建模成功案例斯丹赛部分成功案例斯丹赛部分成功案例u中中国国科科学学院院生生物物物物理理研研究究所所 龚老师成功检测到某基因敲入的F0代果蝇突变体；u北京生命科学研究所北京生命科学研究所 王老师成功获得F0突变体果蝇；u珠海威康健生物科技有限公司珠海威康健生物科技有限公司 杨老师成功获得F0突变体果蝇；u湖南师范大学湖南师范大学 邓老师成功获得F0突变体果蝇果蝇建模成功案例果蝇建模成功案例专业、完善的技术保障保证客户得到一对高活性TALEN质粒并且最终建系/建模成功；拥有强大的技术团体，提供全程免费的技术支持；协助客户完善TALEN 平台的构建；若发生建系/建模失败，则全额退款。

TALEN在在iPS领域的域的应用用用于用于iPS建立的体细胞来源建立的体细胞来源 皮肤成皮肤成纤维细胞胞骨髓来源的骨髓来源的细胞胞脂肪干脂肪干细胞胞肠上皮上皮细胞胞尿液尿液细胞胞-----无无创！！！！毛囊毛囊间充充质干干细胞胞胸腺来源的胸腺来源的细胞胞血液血液细胞胞￿一一切切体体细细胞胞皆皆有有可可能能！！Oct4Oct4Sox2Sox2Klf4Klf4C-mycC-mycTALENTALEN技术技术技术技术iPSiPS细胞细胞基因敲除基因敲除￿iPS￿iPS细胞细胞定点修复定点修复￿￿ ￿￿iPSiPS细胞细胞定向分化定向分化体外研究：疾病模型建立体外研究：疾病模型建立; ;￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿发病过程研究发病过程研究; ;￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿疾病机理研究疾病机理研究; ;￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿药物筛选药物筛选体内应用体内应用再生医学再生医学疾病模型疾病模型——用于疾病机理研究用于疾病机理研究ipsips细胞系细胞系基因敲除的基因敲除的ipsips细胞系细胞系不同组织不同组织研究基因功能及和疾病的影响研究基因功能及和疾病的影响TALENTALEN技术技术定向分化定向分化病人样本病人样本 APOB: 缺失降低HCV病毒的复制效率SORT1：降低肝细胞ApoB分泌； 影响脂肪细胞中葡萄糖转运； 介导运动神经元的死亡 AKT2： 调节肝细胞及脂肪细胞中的 胰岛素通路和糖代谢过程 PLIN1：影响脂肪细胞中脂质分解过程We report here the use of TALENs to rapidly and efficiently generate mutant alleles of 15 genes in cultured somatic cells or human pluripotent stem cells, the latter for which we differentiated both the targeted lines and isogenic control lines into various metabolic cell types. We demonstrate cell-autonomous phenotypes directly linked to disease—dyslipidemia, insulin resistance, hypoglycemia, lipodystrophy, motor-neuron death, and hepatitis C infection. We found little evidence of TALEN off-target effects, but each clonal line nevertheless harbors a significant number of unique mutations. Given the speed and ease with which we were able to derive and characterize these cell lines,we anticipate TALEN-mediated genome editing of human cells becoming a mainstay for the investigation of human biology and disease.iPS细胞系定点修复细胞系定点修复利用利用TALEN、、ZFN技技术成功成功实现对ips细胞的定点修复胞的定点修复！！定点修复后的定点修复后的ips细胞系经细胞系经定向分化得到正常细胞定向分化得到正常细胞！！iPS细胞系定点修复细胞系定点修复iPS细胞系定点修复细胞系定点修复修复后的修复后的ips细胞系定向分化得到的正常细胞可细胞系定向分化得到的正常细胞可提高疾病小鼠的生存率提高疾病小鼠的生存率！！TALENTALEN 的实际应用的实际应用DNADNA水平的基因敲除水平的基因敲除DNADNA水平的定点插入水平的定点插入DNADNA水平的单碱基修饰（点突变）水平的单碱基修饰（点突变）DNADNA水平的水平的miRNAmiRNA敲除敲除以上的各种组合。

以上的各种组合技术革新推动科研进步技术革新推动科研进步上海斯丹赛生物技术有限公司order@市场部：021-58959719market@技术支持：021-38723968service@做科研很难做TALEN不难TALEN尽在斯丹赛谢谢！。