应用红外光谱研究生物大分子的结构.doc

应用红外光谱研究生物大分子的构造谢孟峡 刘媛北京师范大学分析测试中心，北京 100875，一、蛋白质二级构造的测定蛋白质的空间构造重要有四级，其构造层次示意图见图1稳定蛋白质三维构造的重要作用力有五种，分别是盐键、氢键、疏水作用、范德华力和二硫键这些都是共价键互相作用，其中对于二级构造，最重要的作用力是蛋白质分子中的氢键图1 蛋白质构造层次示意图其中：Q为四级构造，T/α为由构造域构成的三级构造或亚基，D/T为构造域或三级构造，sS为超二级构造，S为二级构造，A为构成一级构造的氨基酸在所有已测定的蛋白质中，均有广泛的二级构造存在蛋白质的二级构造形式重要涉及α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲四种这些二级构造中将螺旋当作蛋白质复杂构像的基本，β－折叠是蛋白质中又一种普遍存在的规则构像单元无论是α－螺旋还是β－折叠都存在着许多氢键，致使规则的二级构造都具有相称的刚性，如果一段肽链中没有氢键或其她互相作用，那么各个残基之间就有更大的自由度，转角就是典型的介于此两种状况之间的一种二级构造，是一种部分规则的构像（见图2）此外尚有某些肽段相对于前面的三种二级构造是无规则，它们有更大的任意性，可是这些肽段的构像又不是完全任意的，由于每种蛋白质肽链中存在的这一类型空间构像几乎是相似的，因此蛋白质中无规卷曲也是具有其特定构像的。

α－螺旋平行和反平行β－折叠β－转角图2、蛋白质典型二级构造示意图蛋白质二级构造特性与氢键的形成方式紧密有关，无论α-螺旋、β-折叠、β-转角或其他构象，均有其特定的氢键构造，而这种氢键构造的差别可以在对于氢键敏感的红外光谱中得到反映，重要体现为谱带峰位及半峰宽的变化这使我们有也许运用峰位不同的谱带来辨认不同的二级构造及其构成状况图3 人血清白蛋白（HSA）在重水中的红外吸取谱在蛋白质的红外光谱中，无论是酰氨I带还是酰氨III带，都由代表了不同二级构造的谱峰重叠而成可以通过曲线拟合将重叠在一起的谱峰分开曲线拟合的一般环节是，一方面对得到的蛋白质相应的谱带进行基线校正，然后采用二阶导数和傅立叶去卷积拟定了子峰数目和各子峰位置，通过调节各子峰的高度及半峰宽得到满意的曲线拟合谱图，最后根据拟合谱峰的峰面积定量计算不同二级构造的含量对于各子峰的归属我们也已经做了较多的研究【】酰氨I带中，α-螺旋：1652 cm-1 (H2O); 1650 cm-1 (D2O); 1656 cm-1 , 1658 cm-1 ；非原则α-螺旋（310－Helix）：1660 cm-1；β-折叠：1635 cm-1，1625 cm-1，1620 cm-1 ；反平行β-折叠：1693 cm-1 (H2O); 1675 cm-1 (D2O); 但1675 cm-1 的强度只有低波数的1/10.β-转角： 1660 cm-1 ～ 1700 cm-1无规构造：1657 cm-1 (H2O); 1643 cm-1 (D2O)。

酰氨III带中，α-螺旋：1330~1290 cm-1；β-折叠：1250~1220 cm-1；β-转角：1295~1265 cm-1；无规构造：1270～1245 cm-1；【高等学校化学学报 】图4 蛋白质酰氨I带合酰氨III带拟合成果目前蛋白质的两个谱带分析其二级构造均有一点的局限性，如酰氨I带虽然谱峰归属比较成熟，但是受水汽干扰很严重；而酰氨III带虽然不受水汽干扰，并且不同二级构造在这里的吸取更加特性，但是由于其信号较弱始终以来也没有得到广泛的应用我们一方面提出了将酰氨I带和III带结合起来定量分析蛋白质二级构造的相对含量的措施，该措施可以扬长避短，更加精确的分析蛋白质二级构造二、药物与蛋白质互相作用的研究药物在人体内的分布是由蛋白质控制的，它们由人血清白蛋白储存、携带达到目的组织药物与蛋白质互相作用强度可以用来对药物进行筛选因此研究药物与蛋白作用机理具有十分重要的意义，可以对药物分子的设计提供理论根据多酚类药物重要涉及脂肪多酚有机化合物、多酚苯乙烯酸系列化合物、多酚苯甲酸系列化合物、单宁酸和黄酮类药物多酚有机酸涉及脂肪酸和芳香酸，其中芳香酸有可大体分为苯乙烯酸系列和苯甲酸系列。

目前研究药物与蛋白质互相作用的措施重要有荧光光谱、紫外光谱、平衡透析法以及红外和拉曼光谱法等等运用红外光谱法可以分析蛋白与药物作用前后二级构造的变化运用差谱技术观测药物与蛋白质作用前后红外光谱的变化，推测药物与蛋白质作用的重要基团，蛋白质中氨基酸残基侧链吸取峰的信息，如Tyr, 1515cm-1， His, 1105 cm-1等 同步可以结合其他措施对结合机理、结合部位进行推测以人血清白蛋白（HSA）和苯乙烯酸系列有机酸的互相作用为例，通过红外光谱分析计算可得到蛋白质与药物作用前后二级构造的变化成果见表1其中CI为肉桂酸；CO为香豆酸；CA为咖啡酸表1 HAS与苯乙烯酸系列有机酸作用后二级构造的变化苯乙烯酸系列有机酸（n＝1）药物CI（0.4）CO（11）CA（16）α-螺旋（％）-2.5-4.9-8.1β-折叠（％）-1.5-0.7-1.9β-转角（％）2.74.07.7无规构造（％）1.31.62.4HAS与氯原酸（CLA）和阿魏酸（FA）互相作用后α-螺旋分别减少7％和5％；β-转角分别增长约4％和3％；无规构造约增长3％结合荧光光谱测得两者与HAS的结合位点数均为1，结合强度分别为氯原酸4.37 ⅹ104 ∙M-1，阿魏酸2.23 ⅹ104 ∙M-1。

蛋白质与药物作用前后其酰氨I带和III带的拟合谱图见图5图5 HAS与药物作用前后酰氨I带和III带谱图拟合成果人血清白蛋白与此外三个不同构造有机酸，芥子酸（SA）、没食子酸（GA）和莽草酸（SI），互相作用研究后发现，HSA与实验中最大浓度的芥子酸作用后α-螺旋和β-折叠分别减少了6.2%和2.0%，β-转角和无规构造分别增长了5.0%和3.2%；芥子酸在HSA上有两个结合位点，表观结合强度分别为2.5×103 L∙Mol-1和4.9×108 L∙Mol-1与没食子酸作用后α-螺旋和β-折叠分别减少了5.2%和1.5%，β-转角和无规构造分别增长了5.4%和 1.3%；一种结合位点，KA为1.1×104 L∙Mol-1这三种有机酸的构造见图6图6 a芥子酸，b没食子酸，c 莽草酸水解单宁酸（PGG）与蛋白质的互相作用同样可以应用红外光谱进行研究，结合酰氨I带和III带成果发现，与药物作用后蛋白质构造变得松散与PGG作用后，蛋白质的α-螺旋构造减少了约8％，β-转角和无规构造分别增长了约6％和4％ ，数据成果见表2荧光成果显示随着PGG浓度的增长，它在HSA上有两个个结合位点表观结合强度分别为1.66×104 L∙mol-1 和8.98×108 L∙mol-1 。

人血清白蛋白（HSA）分子是一种具有585个氨基酸残基的单链多肽链，形成9个回折，其间以二硫键相连一般可以将HAS分子划分为三个构造域（I、II、III），每个域又涉及两个子域（IA、IB、IIA……）HAS分子中有两个重要的活性位点，site I位于IIA子域，重要可以和电荷位于分子中央的较大的杂环阴离子结合；site II位于IIIA子域，重要可以结合负电荷位于一端的长链脂肪羧酸上文中谈到的几种有机酸结合位置研究发现，CI、CO、CA、FA和GA在HAS上只有一种结合位点，它也许结合在site I的IIA亚域，而CLA结合在IIIA亚域SA和PGG低浓度时在HAS上有一种结合位点，但是在高浓度时浮现了第二个结合位点应当分别结合在IIA和IIIA亚域第一种位点的结合使蛋白质构造发生了变化，激活了第二个结合位点表2 与水解单宁酸作用前后HAS的二级构造变化CPGG/CHSAAmideα-helix (%)β-sheet (%)β-turn (%)Coil (%)0I54.3±0.423.1±0.416.4±0.36.3±0.1III54.1±0.323.5±0.316.2±0.16.2±0.20.01I54.1±0.223.2±0.216.1±0.16.5±0.1III53.4±0.223.5±0.216.5±0.26.6±0.30.1I51.1±0.122.5±0.317.9±0.28.4±0.3III50.7±0.522.8±0.118.3±0.48.2±0.11I45.8±0.421.7±0.422.3±0.410.2±0.3III46.4±0.321.5±0.221.5±0.210.6±0.42I45.5±0.223.0±0.219.8±0.311.6±0.2III45.6±0.322.0±0.320.8±0.211.7±0.33I45.0±0.522.9±0.120.2±0.311.9±0.2III45.4±0.322.7±0.420.4±0.211.4±0.1苯乙烯酸、苯甲酸和单宁酸等与蛋白质均有特性性的结合，而莽草酸基本上不与蛋白质结合。

莽草酸分子不具有芳香性，其他几种药物都具有芳香性从药物构造分析药物与蛋白的结合机理，可知－COO-1，苯环、酚羟基在结合过程中起到了重要作用人血清白蛋白分子中的活性位点Site I 和 Site II 结合腔的内壁重要由疏水性氨基酸残基构成，而腔的入口处是带正电荷的碱性氨基酸药物分子中的－COO－与腔口带正电荷的碱性氨基酸 Arg257、Arg222、Lys199、His242、Arg218和Lys195发生静电吸引，接近结合腔 苯环与腔中的疏水性残基，如Leu219、Phe223、Leu234、Leu238、Leu260、Ala261等发生疏水性互相作用酚羟基与腔体中的Trp214、Glu292、Phe 211等氢键予以体形成氢键 酚羟基与主肽链的C=O、N-H等基团之间形成氢键，破坏了主链原有的氢键网络，使蛋白质的二级构造发生变化重要体目前α-螺旋 构造的减少，转角构造增长，使蛋白质的亲水性增长，荧光发射峰红移PGG与HSA间的强互相作用也是由其分子构造决定的（其分子构造见图7） PGG分子体积大酚羟数多，非常有助于药物分子和蛋白质之间的结合，特别是多种酚羟基与蛋白质主链及侧链氨基酸之间的氢键作用，使PGG可以牢固的结合在蛋白质上，同步也使维持蛋白质空间构造的力体系发生了变化，导致其构造发生较大变化。

当CPGG/CHSA<0.5时PGG在HAS上的结合位点数n=1，0.5