蛋白质分子量测定.docx

蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过 滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法一、 粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关 性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大通过测定高聚物稀溶 液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量) 该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测 定聚合物的分子量分布粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计二、 凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔 的能力不同而在柱中得以分离分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅， 随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合 物分子后流出通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶 柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并 估算其分子量分布凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用 一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用凝胶层析法测定分子量也有一定的局 限性，在 pH6—8 的范围内，线性关系比较好，但在极端 pH 时，一般蛋白质有可 能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过 5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白 则与此相反，测得的分子量比真实的要小凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计三、 SDS濮胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统 中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多 数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带 上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳 迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所 作的标准曲线，可求得未知物的分子量SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较 低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可一般涉及到蛋白质纯化的实验室 基本都具备但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术SDS-凝胶电泳法所需设备：微型凝胶电泳装置、电源（电压200V, 电流500mA）四、 凝胶渗透色谱法 凝胶渗透色谱法的分离原理与凝胶过滤层析法相同，只是利用高校液相色谱技术实现凝胶层析法分离和测定过程与凝胶过滤层析法相比凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、 重现性好，但设备投入较大，价格较高。

凝胶渗透色谱法所需设备：高效液相色谱仪、溶剂脱气设备、溶剂 过滤器、样品过滤器件其中高效液相色谱仪可选用如下两种系统之一；溶剂脱气设备可选用超声波清洗器：江苏昆山KQ-100E两种备选高效液相色谱系统大连伊利特P230型等度系统基本配置：P230型高压恒流输液泵：1台UV230+型紫外可见检测器：1台Rheod yne 7725i高压六通进样阀：1只EC2000单通道色谱数据处理工作站：1套色谱柱：根据测定蛋白质的分子量不同选取（可咨询色谱仪器公司）岛津高效液相色谱仪LC-10Avp plus（苏州岛津）基本配置LC-10ATVP Plus 输液泵：1 台SPD-10AVP Plus紫外可见双波长检测器：1台LCsolution Lite中文化LC工作站：1套CBM-10AVP Plus系统控制器：1台高压六通进样阀： 1只色谱柱：根据测定蛋白质的分子量不同选取（可咨询色谱仪器公司）粘度法1. 原理分子量是表征化合物特征的基本参数之一但高聚物分子量大小不一，参差不齐，一般在103〜107之间，所以通常所测高聚物的分子量是平均分子量高聚物在稀溶液中的粘度，主要反映了液体在流动时存在着内摩擦。

在测高聚 物溶液粘度求分子量时，常用到下面一些名词忠词符号物理意文纯溶剂粘度溶剂分子与洛剂分子间的内摩擦表现出来的粘度“洛液粘度7溶剂分子与溶列分子间、高分子与高分于键和高分子与洛剂分子之 闾’三者内摩擦的综合表现相对粘度串一踽客溶液粘度对溶剂粘度的相对值增比粘度加=伞一1高分子与高分子2问纯溶剂与高分子之何的内摩擦效应比浓粘度单位浓度下所显示出的粘度特性粘度17]反映高务于与溶剂分于之间的内理擦如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大表现出的特性粘度也大特性粘度和分子量之间的经验关系式为：[7] = KMa ； (1)式中，M为粘均分子量；K为比例常数；a是与分子形状有关的经验参数K和a值 与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关K值受温度的影响较明显， 而a值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数值解在0.5〜1 之间K与a的数值可通过其他绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等，从粘度 法只能测定[刃在无限稀释条件下(2)获得W]的方法有二种：一种是以n /C对C作图，外推到C-0的截距值；另一种sp是以ln“/C对C作图，也外推到C-0的截距，两根线会合于一点。

方程为：r晋二［"］_0［打 C：测定粘度的方法主要有毛细管法、转筒法和落球法在测定高聚物分子的特性粘度时，以毛细管流出法的粘度计最为方便若液体在毛细管粘度计中，因重力作用流出时，可通过泊肃叶公式计算粘度m=1) 对于某一只指定的粘度计而言，(4)可以写成下式省略忽略相关值，可写成：式中，t为溶液的流出时间；t0为纯溶剂的流出时间可以通过溶剂和溶液在毛细管中的流出时间，从(6)式求得n r，再由图求得［处2.仪器恒温槽1套；乌倍路德粘度计1只；移液管(10mL) 2只，(5mL)1只；秒表,吸耳球，螺旋夹；橡皮管；3. 步骤(以聚丙烯酰胺分子量测定为例)测定所用的乌倍路德粘度计，又叫气承悬柱式粘度计他的最大优点是可以在 粘度计里逐渐稀释从而节省许多操作手续1) ． 先用洗液将仪器洗净，再用自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注 意反复流洗毛细管部分，洗好后烘干备用2) .调节恒温槽温度至3O.OO°C，在粘度计的B管和C管上都套上橡皮管，然后 将其垂直放入恒温槽，使水面完全浸没G球3) ． 溶液流出时间的测定用移液管分别吸取已知浓度的聚丙烯酰胺溶液10mL和硝酸钠溶液(3 mol • dm-3)5mL，由A管注入粘度计中，在C管处用洗耳 球打气，使溶液混合均匀，浓度记为C],恒温10min,进行测定。

测定方法如下： 将C管用夹子夹紧使之不通气，在B管用吸耳球将溶液从F球经D球、毛细管、E球抽 至G球2/3处，解去夹子，让C管通大气，此时D球内的溶液即回入F球，使毛细管以 上的液体悬空毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即开始计时，当液 面降至b刻度时，停止计时，测得刻度a,b之间的液体流经毛细管所需时间重复这 一操作三次，它们间相差不大于0.3s，取三次的平均值为q然后依次由A管用移液管加入5mL,5mL,5mL,5mL硝酸钠溶液(1 mol • dm-3)， 将溶液稀释，使溶液浓度分别为c2,c3,c4,c5，用同法测定每份溶液流经毛细管的时 间t2，t3,t4,t5应注意每次加入硝酸钠溶液后，要充分混合均匀，并抽洗粘度计的E球 和G球，使粘度计内溶液各处的浓度相等4) ．溶剂流出时间的测定用蒸馏水洗净粘度计，尤其要反复流洗粘度计的毛细管部分用1 mol・ dm-3 的硝酸钠洗1〜2次，然后由A管加入约15mL 1 mol • dm-3硝酸钠溶液用同法测定溶 剂流出的时间t04. 数据记录(1)．数据记录实验温嗖30度00373聚内烯坯加沫度0.002g-JinL0.66(2)．作图由回归直线截矩得［n］二(3)． 由公式代入数据得[7] = KM°咼聚物溶剂t/°C103Kdm^kg-ia分子量范围 MX10-4聚丙烯酰胺水306.310.802〜50水30680.661〜20ImoLdm-3 NaNO33037.50.66聚丙烯腈二甲基甲酰胺2516.60.815〜27聚甲基丙烯酸甲酯苯253.80.7924 〜450丙酮257.50.703〜93聚乙烯醇水25200.760.6 〜2.1水3066.60.640.6 〜16聚苯乙烯甲苯25170.691 〜160聚己内酰胺40%H2SO42559.20.690.3 〜1.3聚醋酸乙烯酯丙酮2510.80.720.9 〜2.5摘自:印永嘉主编.大学化学手册.山东科学技术出版社.1985:692二、凝胶过滤层析法1. 原理：凝胶层析法(即凝胶过滤法，gel filtration)是利用凝胶把分子大小不同的 物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法(molecular sieve chromatography)， 排阻层析法( exclusion chromatography)。

凝胶本身是一种分子筛，它可以把分 子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样但这种“过 筛”与普通的过筛不一样将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然 后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中， 大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进 入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质 得到分离凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝 胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构凝胶层析法常用的天然凝胶是琼 脂糖凝胶(agarose gel，商品名Sepharose)，人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝 胶(商品名为Bio-gel-P)和葡聚糖(dextran)凝胶，后者的商品名称为Sephadex 型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于 水这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的 数量级在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过， 适于分离小分子物质相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质利用这 种性质可分离不同分子量的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为 “总体积”，以 Vt (total volume)表示实际上Vt是由VVi与Vg三部分组成，即：Vt=Vo+Vi+VgV称为“孔隙体积”或“外体积"(outer volume)又称“外水体积”，即存在于 柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体 积；Vi为内体积(inner volume)，又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的 体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt — Vo等于Vi+Vg它们之间的关系可l u 丄 £用图 17-3 表示洗脱体积（Ve, elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下。