荧光显微镜.docx

荧光显微镜讲授流程：1、 构造2、 原理3、 发展史荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种它除了具有光学显微镜的 基本结构和光学放大作用外，基于荧光的特性，还具备以下独特的功能要求：(1) 提供足够能量的能激发出荧光的光源2) 有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片，从光源中选择合适的激发光谱，使析出的 光谱与该物质的吸收光谱重合，以期望获得最大的荧光3) 为获得较弱的荧光图像，还要建立一套截止滤色片，它使所需观察的荧光进入系统成像，而 将其余的光波，包括发射光阻挡在外，用来提高图像的衬度4) 放大的光学系统应适应荧光的特性，最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良 好衬度的荧光图像5) 仪器的安全性应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸，保证电器安全滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体，后改用带色胶质片，由于易变色和使用不方便已被淘 汰现在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片，透过波段宽，透过率随厚 度而降低，价格相对低廉由于色玻璃与空气的界面上，约有4%光线被反射掉，玻片愈多,光能损失愈大，限 制了它的使用性能干涉滤色片的出现，可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片，从而促使荧光 显微术的进展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。

荧光显微镜的应用1. 在环境中检测已知微生物，制作相应的带有荧光素的抗体，进行标记、定位(免疫荧 光技术)对病原微生物的检测有意义---梅毒密螺旋体2. 荧光显微镜下的细胞增殖(超链接-视频)3. 选用不适合同的荧光染色剂，对同一视野下的样品进行染色(复杂环境下)4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛，在植物细胞的观察研究中，通过染色可以更清 晰地观测到细胞的形态及结构在实验中发现，荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植 物叶的气孔器，而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌40年代创 造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中, 可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨 病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等6. 在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后，用荧光显微镜能够很清晰地观察到活 细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细 胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

利用荧光标记技术显示微管，可以在多种植物生殖细胞内清楚 地看到微管骨架的存在7•在紫外光激发下，叶绿体发出火红色荧光，气孔发绿色荧光，保卫细胞呈黄色或黄绿色，且形 状大小非常清晰，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈表皮细胞内的叶绿 体数量要比叶肉细胞少，所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞通过大量试验证明，单子叶， 双子叶，裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光图中用暗场 聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上，截止滤色片(SF)吸收被 切片衍射的杂散激发光，仅透过荧光到目镜(OC)DC—暗场聚光镜;OB—物镜;SF—截止滤色片;OC—目镜图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜明场聚光镜很少直接用于荧光检测电常用来搜索 目标，寻找或挑选切片需要的区域，这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成，否则会出现衰减甚 至猝灭，当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜，在调节可变光适当时,也可获得满意 的荧光图像暗场聚光镜在透射荧光中是必备的，由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗” 色，使荧光衬度大大提高。

荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐，并且能透过紫外线的材料图9 所示是一种心形暗场聚光镜，它的心脏形反射面将光线高度会聚成一 “点”，聚光镜的性能可用下式 表征E=K0P(NA2max-NA2min)K为透过率可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差，差值愈大, 性能愈优越暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物，为得到稳定的荧光图像，聚光镜的调节机构(对中 和调焦)应稳定可靠，可多次重复照明条件另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm〜1mm之间才获得暗场效应，这是因为受 到暗场光锥顶点深度的限制好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光 物二向色分光镜能通过物镜收集荧光截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中 观察DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件，它是多层膜干涉滤色片，与主光路呈45°安置，它的光谱 特性如图11所示该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得，从380n m 〜400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。

以50%的反射率时的波长 作为表征，如该曲线为500nm,记为DM-500图11二向色镜透射曲线图12落射照明光路各个分色镜还应建立相应的激发和截止滤色片,以满足不同的需要滤色片(包括二向色分镜)的设置与组合是荧光显微镜设计中一个重要的课题它与荧光术 的应用密切相关落射式激发光通过物镜垂直自上而下照明切片上表面，故又称为垂直照明器,它采用柯勒照 明系统光源经集光镜大致成平行光束,为利用光能,增大包容角,用隔热玻璃吸收热线，聚光镜使光 源成像于孔径光阑上，并使它与物镜后焦面重合，所以经物镜出射激发光束为平行光均匀投射到切片上 要注意的是仪器配备的所有物镜均应达到此要求这两种基本形式,各有特点和使用价值对于落射式：(1) 物镜兼作聚光镜，就没有聚光镜的定中与调焦问题，而且物镜的数值孔径随倍率而增大， 荧光图像亮度也随之提高；(2) 激发光不必透过载玻片,因而减少损失，而且激发光与荧光对物镜而言方向相反，分得很 开不可能产生互相干扰，就是有部分反射激发光进入物镜后也被二向色分光镜反射至光源仅有极小 部分透过，使截止滤色片负担小，可制成较薄的片；(3) 用透射式激发时,大部分荧光产生于切片底部，必须透过切片射出，而且还会产生散射。

而 落射照明和观察面在同一表面，荧光图象亮度毫无损耗,而且对象质也无影响，特别对厚的切片，如 菌落和组织培养等更具有独特的功能；(4) 落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱,因此必须要考虑紫外段的透过率,为此专门研制 UV-F 透紫外区荧光物镜系列，而透射式则不必对于透射式，在UV,U激发时一般用优良的消色差物镜即可，在可见光B与G激发时，用半复 消色差或复消色物镜最为合适，用齐明物镜也可以，虽然齐明物镜象场不平，然而高倍物镜用于 对边缘分辨力要求不高的试样一般中等以下倍率，干物镜适用于暗场照明高倍率的浸液物镜不适合 暗场照明，因为暗场聚光镜照明锥光束会进入物镜浸液式物镜比干镜头更适宜作落射照明，因为空气一 玻璃界面反射光远比玻璃一浸液界面反射光多对于目镜没有特殊要求由两种基本形式组合，具有更大机动性,适应各种研究需要图13(a)(b)中透射(明场或暗场)用来搜索定位，也可以用来比较荧光部位和不发荧光部位的 细微结构;(d)和(e)也有相同的功能d)中使用相衬时，要用相衬物镜,交替进行荧光观察和相衬观 察,进行比较；(e )中偏光观察适用于双折射物质,(c)中落射荧光和透射荧光的组合适用于双重染色如 同时进行FITC和TRITC双重染色，则可用落射观察TRITC,用透射观察FITC标识过的部位。

• 28 • 光学仪器第23卷另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm〜1mm之间才获得暗场效应，这是因为受 到暗场光锥顶点深度的限制好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光 物二向色分光镜能通过物镜收集荧光截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中 观察DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件，它是多层膜干涉滤色片，与主光路呈45°安置，它的光谱 特性如图11所示该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得，从380n m 〜400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过以50%的反射率时的波长 作为表征，如该曲线为500nm,记为DM-500图11二向色镜透射曲线图12中激发滤色片从高亮度的汞灯(或氙灯)中主要透过绿光,经双色分光镜反射至物镜， 落射照明切片，其中一些激发光在盖玻片和物镜表面反射回去，被截止滤色片吸收，只有切片发出的 橙色荧光，才能透过进入目镜二向色分光镜将光源发出的光谱分为两段(故称二向色),一段反射作为激发光，一段透过荧光。

显然二向色分光光谱段太宽，还必须配备激发滤色片和附加的截止滤色片适应荧光观察为了覆盖光谱区应设置多少二向色分光镜?一般分4个波段，如用DM-400、DM-445、DM-505 和DM-575为一组近年来，有的厂家又细化些，配置6个分色镜,它们是DM-400、DM-430、DM-455、DM-505 > DM-575 和 DM-595・27 •第2期杨广烈：荧光与荧光显微镜荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式透射式如图8所示，它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光图中用暗场 聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上，截止滤色片(SF)吸收被 切片衍射的杂散激发光，仅透过荧光到目镜(OC)DC—暗场聚光镜;OB—物镜;SF—截止滤色片;OC—目镜图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜明场聚光镜很少直接用于荧光检测电常用来搜索 目标，寻找或挑选切片需要的区域，这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成，否则会出现衰减甚 至猝灭，当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜，在调节可变光适当时,也可获得满意 的荧光图像暗场聚光镜在透射荧光中是必备的，由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗” 色，使荧光衬度大大提高。

荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐，并且能透过紫外线的材料图9 所示是一种心形暗场聚光镜，它的心脏形反射面将光线高度会聚成一 “点”，聚光镜的性能可用下式 表征E=K0P(NA2max-NA2min)K为透过率可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差，差值愈大, 性能愈优越暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物，为得到稳定的荧光图像，聚光镜的调节机构(对中 和调焦)应稳定可靠，可多次重复照明条件荧光检测自1908年第一台荧光显微镜问世以来，不断地得到改进和完善高压汞灯的出现; 多层镀膜技术满足了激发和截止滤色片的要求;高性能优质光学系统的荧光显微镜出现，也促使了 80年代免疫荧光的发展90年代问世的激。