利用蚕豆根尖微核技术检查河流污染情况调查报告毕业论文.doc

利用蚕豆根尖微核技术检测成都市区河流水质污染——锦江河 林茂大厦至新村桥河段1. 引言人们早在很久以前就道微核在细胞中存在，早期的血液学文献中，就曾经有过对微核的描述多年来，染色体异常的结果会产生微核已经成为一种共识而将微核作为快速监测环境中致突变因子的方法之一，那么是近年来的开展微核测定是根据在细胞质内产生额外小核的现象来判断理化因素诱导染色体异常作用的一种简便的体内实验方法微核与染色体畸变有密切联系，可以说它是染色体畸变的另一种表现形式自上世纪七十年代初，Biiler和Schmid[1,2]建立这一方法以来，经过不断改良和开展，目前已在辐射损伤、药物、工业毒物、农业等独立工作中得到应用，尤其是建立了紫露草花粉母细胞四分体微核检测系统和蚕豆根尖细胞微核监测系统后，细胞微核技术在环境污染监测方面得到广泛的推广和应用蚕豆根尖细胞微核技术已被我国国家环境保护局审定编入了“生物监测技术标准〞在全国推广应用[3]，成为监测淡水污染的报警系统和监测系统1.1 蚕豆根尖微核技术简介 蚕豆根尖微核技术的开展蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料它的染色体为六对相当大的染色体，而且根尖含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察。

早在1959年，放射生物科学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究到了70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已开展得相当成熟，作为一种监测化学品遗传学毒性的方法为人们所知，并广泛采用而蚕豆根尖的微核实验是1982年由Degrassi和Rizzoni正式创立的[4]，他们指出微核实验 染色体畸变实验同样具有准确、快速、有明显的剂量——效应关系等特点，操作更简便，也更适于大批量样品的检测，并提出建立检测淡水污染诱变剂的警报系统陈荣耀、金波等[5.6]从1983年开始陆续发表了?利用蚕豆根尖的MNT检测农药和诱变剂损伤?、?蚕豆根尖细胞微核试验敏感品种的筛选?等系列论文，筛选并应用敏感品种—松滋青皮豆，监测湖泊水质污染，提出了“污染指数法〞[7]，首先在国内建立了利用蚕豆初生根尖微核〔Micro-nuclear〕技术监测淡水污染的报警系统和监测系统1986年——1988年，陈荣耀和金波等人[8]建立了利用蚕豆叶尖细胞的MNT〔Micro-nuclear technology〕监测大气污染的测试系统1992年他们又发表了蚕豆细胞微核技术监测农业土壤的研究论文[9]至此，他们研究建立的蚕豆细胞微核检测/监测系统能全面用于环境水、土、气污染的监测，成为国内较为完善、成熟并被国家有关部门确认的一个遗传毒理学检测/监测系统。

此后，这项技术在环境污染监测中得到了积极的推广和应用 蚕豆根尖微核技术的应用蚕豆根尖微核试验的一个主要应用领域就 是检测水体的致突变性在自然水体方面,陈荣耀等引入污染指数的概念把微核率与污染程度联系起来[7] ，根据测试水样微核率与自来水对照的比例,确定污染指数，再根据污染指数的大小进行水体污染分区孔志明、王永兴等那么将此方法用于监测太湖水质,发现在指示水体污染时，蚕豆根尖微核率与一些化学指标如COD、氨氮等呈正相关,而与DO显著负相关，说明蚕豆根尖微核试验在一定程度上可指示水体的水质优劣[10 ,11] ；在污染水体方面，该法可用于排污口废水的致突变性筛选和整个河段污染源的调查；另外，蚕豆根尖微核试验还可用于水源水、饮用水、医院污水、磁处理水等致突变性的检测值得一提的是,虽然蚕豆根尖微核试验并不是化学品平安测试的标准方法,但仍有不少报道证明蚕豆根尖微核试验对一些具体的化学污染物的致突变性也有敏感的指示作用[12~14] 如果对三类致癌物(确信致癌物、可能致癌物和潜在致癌物)进行系统的测试，可以较科学地评价该试验对于化学品致癌性初筛的可能性由于水污染与人群健康紧密相关，尤其是饮用水致突变性与人消化道肿瘤有着密切的联系，越来越多的研究把蚕豆根尖微核试验应用于环境流行病学，特别是肿瘤流行病学当中。

在几个著名的高发现场,都有关于蚕豆根尖微核试验监测水体致突变性的研究报道叶本法等[15]结合化学分析和病例对照，研究了江苏淮安食管癌现场的致病因素经流行病学Logistic 回归分析和蚕豆根尖微核实验说明:水污染程度与微核出现率有剂效——应关系，污染严重的水域其微核率平均值与自来水对照有极显著的差异，提示水污染是当地食管癌高发的一个重要危险因素王旭全等在测定长乐胃癌高发区的塘水、 河水、 井水致突变性的同时，监测了水中的一些有机污染指标,对水体致突变的来源作了较为系统的分析[16]水样采自长乐县21 个村，其中塘水6 份，河水7 份，浅井水8 份结果说明当地3 种饮用水均能在一定程度上诱发蚕豆根尖微核率升高诱发微核效应的能力为河水> 塘水> 井水同时测定的指标还有氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氨及耗氧量等结果发现微核率的上下与水样的有机污染严重程度趋势一致在广西抚绥肝癌高发区，也有人做了饮用水诱发蚕豆根尖微核率与肝癌发病率关系的调查[17]结果说明，25 份饮用水样中有12 份塘水能明显诱导蚕豆根尖微核率的增高，提示饮用塘水中存在致染色体畸变的物质，摄入这类物质可能会增加当地居民患肝癌的潜在危险。

另一组试验同时也证明,这类物质与当地居民肝癌的发病率有相关性 [18]这为肝癌的饮用水污染病因理论提供了实验依据总之，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系随着科学的开展，其应用范围还将进一步扩大1.1.3 蚕豆根尖技术的优缺点目前，在水体致突变性检测方面的成熟方法有很多，新方法也层出不穷，但应用于环境污染的大范围、大样本的遗传毒性检测，却仍然是为数不多的几种经典方法，如Ames试验和各种微核试验蚕豆根尖微核试验作为 其中之一，具有许多其它测试手段无法比较的优点首先，它的可靠性和灵敏性较高其次，蚕豆根尖微核试验的本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的第三，它的检测物谱较广第四，在方法学上，它也特别适合环境致突变性监测和肿瘤流行病学调查与其它动物试验或细胞学试验相比，试验材料容易获得，仪器设备简单，也不损害工作人员的健康；与其它植物测试相比，它还具有个体差异小及不受地理、气候条件限制等优点这几点保证了它的普及性,特别适合于开展中国家及县、市级以下的监测点但是，蚕豆根尖微核试验也存在一些缺乏之处首先它毕竟不是动物细胞试验，缺乏一定的代谢活化系统，其次它无法根据结果直接指示受试样品中致突变物的类型和诱变机制，第三，微核的判定、计数容易带有一定的主观性。

尽管蚕豆根尖微核试验与目前一些其它的细胞或分子生物学检测方法相比有某些方面的缺乏，但由于该方法的简便、快速及其经济性,在环境监测、污染调查中作为致突变性大范围筛选还是十分有价值的虽然这是一个已经成熟的方法,但是并没有过时与其它的化学或生物测试方法联合使用，还将进一步扩大它的应用前景1.2 蚕豆根尖微核形成的机制关于细胞微核的形成有多种假说Heddle[19]和Shmidt[20] 阐述了 细胞质中微核的来源有两个方面:一是断裂或无着丝点染色体环在细胞分裂后期不能定向移动,而遗留在细胞质中；二是有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体断片在细胞分裂后期被留在细胞质中，因而微核试验既能检出断裂剂又能检出有丝分裂毒物因为只有在第一个细胞分裂周期后才能观察到微核，所以在一个细胞群中所观察到的微核的频数依赖于细胞增殖动力学除此之外，微核的形成还有另外几种可能的途径<1> Rugh1964[21]曾指出，微核可能是由于细胞核向外突出并延伸而成陈荣耀、金波等〔1985〕在蚕豆根尖、叶尖细胞微核试验中，也观察到核突出类似核出芽现象<2> Maier等〔1976〕[22]认为大微核可能是由于细胞分裂进入后期，一条或几条染色体落后，末期滞留在细胞质中而形成。

陈荣耀、金波等〔1985〕在蚕豆微核试验中，也观察到一条或几条染色体落后及末期桥现象<3> Schleich[23]等提出，微核可能来源于间期细胞核的碎片；陈荣耀、金波等在蚕豆微核试验中看到一种没有明显主核，只有大小不等的数个小核在一起的现象，他们称之为“粉碎性微核〞，认为这可能是核膜破裂，细胞核变成多个核的碎片而形成1.3 微核识别的标准目前多数学者认为，在镜检细胞微核时，应按以下标准计 数微核：〔1〕凡主核大小1/3以下，与主核别离的小核；〔2〕小核的着色与主核相当或稍浅；〔3〕小核形态可为圆形，不规那么等1.4 实验数据的统计处理和污染程度的划分 各测试样品〔包括对照组〕微核千分率〔MCN‰〕的计算对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式MCN‰= × 1000‰污染指数〔PI〕判断如果采用市售蚕豆种子，按标准操作标准实验条件〔其对照本底为10‰以下〕，其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数〔PI〕〞判断MCN‰= × 1000‰根据?全国生物技术监测标准—蚕豆根尖微核技术?规定的污染指数划分标准，采用污染指数〔PI〕值来划分受污染程度此方法可防止因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，标准见表1[24] 。

凡数值在上、下限时定为上一级污染表1 污染指数PI值评价水质标准表Table1 Pollution Index for evaluation of water quality standards value of PI table污染指数PI值 水质污染等级0 ～ 1.5 根本无污染1.5 ～ 2.0 轻污染2.0 ～ 3.5 中污染3.5以上 重污染1.5 研究目的与意义随着世界人口经济的增长，城市工业化的开展，工业三废不断排放，城市污水量在逐年增加，污水成分日趋复杂，污水中含有大量的病原体、致敏原、致癌原以及对人有急慢性毒作用的化学物质和放射性物质本研究中用蚕豆根尖细胞微核技术监测成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段的水质污染情况其目的是利用生物监测对成都市锦江河的水质污染状况给出客观的评价，同时说明蚕豆根尖细胞MCN对生活污水很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于生活污水的监测2. 材料与方法2.1 实验材料 蚕豆种子来至于四川师范大学生命科学学院细胞生物学研究室的市售蚕豆种子，在陈荣耀，金波等的研究中已证明是微核试验敏感品种。

其本底MCN‰一般在10‰以下2.1.2 水样采集锦江河是成都市区最重要的河流之一，其居民的生活污水大局部都排放在其中本次水样采集地点是在成都市锦江河林茂大厦至新桥村河段，并分别在其林茂大厦、九里桥、新村桥三点采集水样，避光保存在4℃的环境中其具体情况见表2与图1表2 采集水样时间与地点表Table2 The time an location of acquisition water采样地点采集时间林茂大厦九里桥新桥村2008年3月27日中午1时 2008年4月8日下午2时 2008年4月8日下午3时图1 水样采集地点分布图 Fig1 Distribution of sampling section2.2 研究方法根本按照?生物科技活动和生物使用技术?进行，并做局部改良2.2.1 蚕豆浸种催芽用蒸馏水浸种置25℃水浴箱内浸泡24h〔其间用25℃蒸馏水换水两次〕，用培养皿在25℃水浴箱中催芽48h—60h，注意保持湿度 被检测水样处理根尖 在将三个地方的。