第7讲植物细胞培养生产代谢产物ii资料.ppt

第7讲,植物细胞培养制备代谢产物II,本节主要内容：,1.植物细胞培养生产次级代谢产物的技术方法 2 2.植物细胞培养生产次级代谢产物的讨论,本节关键问题：,影响植物细胞培养生产次级代谢产物的因素及调控方法,一 代谢产物,初级代谢产物（Primary metabolites）：是通过 初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质， 如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等在不同种类 的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同初级 代谢产物的合成无时无刻都在进行着，任何一种 产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活 动，甚至导致死亡次级代谢产物（Secondary metabolites） 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点二 植物细胞培养生产代谢产物的意义 一个例子：紫杉醇,紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植物 中分离得到的一种双萜类化合物化 C47H51NO14， 分子量：853.90 用途： 具有良好的抗癌活性，尤其对晚期 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 十分显著的疗效 制备途径： 1.直接从红豆杉中提取 2.化学全合成；化学半合成 3.植物细胞培养 4.内生真菌培养,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、 木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩 芽中含量最高，心材最低。

一般含量为0.005% 左右生 产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵若光从树 皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树 无法满足市场需求，破坏宝贵资源、不可持续发展化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率,仅4-5%有效途径：红豆杉细胞培养制备紫杉醇,1.从树叶获取细胞，利于资源保护（红豆杉属于濒危保护植物） 2.细胞培养不受地理环境影响：地理环境、病虫害和季节等 因素的影响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产 3.利用生物技术提高目标产物含量，实现大规模培养制备 （1）可以通过进行红豆杉细胞的筛选，获得超过原植株紫杉醇含量的细胞 （2）易于在生物反应器中满足最佳条件，进行大规模、高密度地培养 （3）可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究，利用代谢调控使细胞定向合成有用次生代谢物紫草素：为植物色素之一种（萘 醌）存在紫草植物中抗癌、 抗炎、抗菌等日本在1983年用 大规模紫草细胞培养来生产紫草 素灵芝酸：是灵芝中除多糖外另一 类具有广泛生理活性的物质,被证 明具有止痛、镇静、抑制组织胺 释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活 性人参皂苷：对人体神经系统、循 环系统、血液系统等具有广泛的 生物活性。

三 植物细胞培养生产次级代谢产物,（一）细胞株筛选,细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化， 获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的 不均一的细胞群体细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的 细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由 单细胞增殖形成的细胞群 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)细胞株和细胞系的区别,1 名词的由来： 细胞株（cell strain）最初为W.Earle（1940）所采用，他把自己建立的小鼠结缔组织L系称为“株” 1951年，George Gey把其建立的人体宫颈癌细胞Hela系称为“株” 1954年，White另外使用了“系”来称呼A Carrel培养的鸡胚心脏的细胞群,,2 名词使用的现实情况 2．1 中学教材定义在人教版高中生物（选修）全一册第70页中， 细胞株被定义为经原代培养的组织细胞，培养到第10代左右，度过第一次死亡危机后的细胞群，这种细胞的遗传物质没有发生改变； 细胞系则被定义为可以度过第二次死亡危机，传代培养到40~50代的细胞，这部分细胞的遗传物质发生了部分改变并且细胞带有癌变的特点，这种细胞在适宜条件下无限传代。

2．2 文献定义由新鲜组织制成的细胞培养物称原代细胞，这种细胞经首次传代成功后的细胞称做细胞系，可泛指一般可能传代的细胞 若用胰蛋白酶等将原代细胞消解分散后，再培养一代，称次代培养 如果不能继续传代或传代有限，可称为“有限细胞系（finite cell line）”或“已建立的细胞系（established line）”能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）” 从一个经过生物学鉴定的细胞系或原代培养物用单细胞分离培养或通过筛选的方法，克隆具有特殊性质或标志的单细胞获得的细胞群，称细胞株3 比较不同观点得出的结论 3．1 矛盾性：人教版高中生物教材中细胞株和细胞系的概念内涵与文献中的概念内涵不同甚至完全相反 人教版高中生物细胞株概念强调结束原代培养并可以进行传代培养的细胞群，并不强调细胞群的纯度；文献中的细胞株概念强调细胞群的纯度，认为细胞株是克隆的结果人教版高中生物细胞系概念强调这些细胞已发生部分遗传物质的改变，带有癌变的可以传代培养的细胞群；文献中的细胞系概念强调细胞系是首次传代成功后的细胞群3．2 划分标准 人教版高中生物细胞系和细胞株定义以传代代数为标志区分，以遗传物质是否改变为标志； 专业文献中这两个概念与传代代数无关，遗传物质的改变与否并不做要求。

细胞株强调细胞培养物中细胞成分单一性，所有的遗传、生化等特性完全相同； 细胞系不强调纯度，但应该有某一类细胞占绝大数细胞株指标,（1）分散性好，适合大规模悬浮培养2）均一性好，细胞大小、生理状态一致 （3）生长速度快，培养周期短，不易染菌 （4）目标产物含量高，容易分离提取 （5）细胞遗传稳定适合工业生产用细胞株的一般筛选流程,1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位 作为外植体诱导愈伤组织愈伤组织形成后，进行继代 培养2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体,培养基继代培养，挑选生长快速的细胞3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，,从中选择分散性好、生长速度快的细胞4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产,物含量高的细胞株5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物,合成的稳定性6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种细胞株定向富集驯化,例如：激素自养型细胞株的筛选驯化：,将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分 裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好 的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自 养型细胞。

二）次级代谢产物生物合成,莽草酸途径：喹 啉类、异喹啉类 、吡咯啶类、乌 头类、吲哚类、 大环类生物碱等 聚酮途径：聚酮 类化合物甲戊二羟酸途径 ：萜类、甾体紫杉醇（双萜类）生物合成 4个异戊二烯——GGPP——19个酶促反应（Bacctin直接前体）、,C13侧链合成——紫杉醇,GGPP,产物积累与细胞生长关系,a生长偶联型：产物合成发生在细胞生长过程中，到达平台期后 合成停止b中间型：产物合成出现在细胞生长旺盛阶段，在平台期也能合 成，但是速度减缓c非生长偶联型：产物合成出现在细胞生长平台期三）工艺流程,（四）影响次级代谢产物的因素,1 1.生物因素,（1）细胞株,稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培,养生产代谢产物的前提在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须 弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同 部位来源细胞的特性缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细,胞培养生产的主要限制之一2）细胞凋亡,细胞凋亡（Cell apoptosis），也叫程序性细胞死亡（ Programmed cell death，PCD），是机体维持环境稳定 、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。

细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以,通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡关键是要保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累,，这可以通过采用合适的培养工艺来实现3）细胞团,植物细胞容易聚集成团，每个细胞团一般由4-300个 细胞组成，大小因植物细胞种类不同具有较大差 异，例如：烟草细胞团直径大约在350-1000μm ，长春花细胞团在40-2000μm之间细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造 成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的 细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异此外 ，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液 粘度增加，致使气体交换与传递受到影响要保 持反应器良好的混合效果适当大小的细胞团有利于代谢产物积累4）生物合成机制,次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及 多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因 素非常多结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途 径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题 ，有利于指导建立优化的培养工艺与技术2.化学因素,主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、,前体和调节因子等1）营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长 ；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代 谢产物。

普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于 第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目 的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积 聚目标产物2）前体（precursor ）,指某一代谢中间体的前一阶段的物质一般在生物 合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都 可以说是该阶段物质的前体物质缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物 如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该 代谢产物或使其产量增加3）诱导子,狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞 内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关 的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最 终使细胞次生代谢水平发生改变的物质广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力， 进而提高细胞次生代谢水平的外界因素温度、光照、 紫外线、红外线等都是广义诱导子从来源上可以分为外源性和内源性诱导子，后者是指在外界,信号刺激下细胞合成的物质从性质上可以分为生物与化学诱导子4）反馈抑制,• 植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对,目标产物的合成具有反馈抑制• 例如：直线式反馈控制（Straight linear feedback contro1) ：当末端代谢产物达到 一定浓度时，就会抑制该代谢途径，通常是抑 制第一种酶的活性。

• 可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技,术可以克服在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者 具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、 下两相，细胞在水相中生长合成次生代谢物质， 分泌出来的产物被转移至有机相中不仅减少了 产物的反馈抑制作用，而且实现收获的连续化 例如： （1）在紫草细胞悬浮培养时加入十六烷不仅可 以原位提取紫草宁色素，而且可以使产量提高 （2）采用对紫杉醇有高分配系数的十六烷、油 酸等进行东北红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇， 结果好于一般悬浮培养，有机相中紫杉醇含量远 高于水相和细胞内紫杉醇 （3）在培养的花菱草细胞中加入一种液体硅胶 可使血根碱（sanguinarine）产量大幅度提高3.物理因素,主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等 （1）光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影 响光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产 物合成和积聚产生作用光对许多酶有诱导或抑 制作用2）温度：温度会影响酶的活性细胞的生长速率 与培养温度紧密相关植物细胞培养一般在25℃ 左右进行3）pH,会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从。