实验十二微丝的观察荧光探针标记ppt课件.ppt

实验十二实验十二 微丝的察看微丝的察看〔荧光探针标志〕〔荧光探针标志〕一 实验目的•1 学会运用细胞涂片机•2 掌握微丝显示的方法•3 熟练运用荧光显微镜二 实验原理•Actin-Tracker Green是一种Actin绿色荧光探针，可以用于培育细胞或组织切片的Actin特异性荧光染色•က Actin-Tracker Green探针为荧光染料FITC标志的毒蕈肽〔phalloidin〕，即phalloidin-FITC，其分子量约为1251.4，最大激发波长为496nm，最大发射波长为516nm•က 本产品可以用于细胞或组织内的微丝〔microfilament〕的荧光检测•က 本产品运用时的引荐稀释比例为1:200假设每个片子需求运用200μl染色任务液，每个包装的本产品足够用于200个片子三 实验步骤•a. 用用PBS洗洗涤细胞或胞或组织切片切片2次或采用次或采用细胞涂片机离胞涂片机离心涂片•b. 用用PBS配制的配制的3.7%甲甲醛溶液室温固定溶液室温固定细胞或胞或组织切片切片约10分分钟留意：甲醇可以破坏留意：甲醇可以破坏actin蛋白，因此不能运蛋白，因此不能运用含有甲醇的固定液。

并且尽量运用不含甲醇的甲用含有甲醇的固定液并且尽量运用不含甲醇的甲醛•c. 用或含用或含0.1% Triton X-100的的PBS洗洗涤2-4次，每次次，每次约5分分钟•d. 用含有用含有2%BSA和和0.1% Triton X-100的的PBS按照按照1:200的比例稀的比例稀释Actin-Tracker Green，例如，例如5μl Actin-Tracker Green用用1ml稀稀释液稀液稀释，稀，稀释后的溶液即后的溶液即为Actin-Tracker Green染色任染色任务液•稀稀释比例可以根据比例可以根据实践染色效果践染色效果进展适当展适当调整•e. 把把Actin-tracker Green染色任染色任务液按照每个片子液按照每个片子约200μl的比例滴加到片子上，室温避光孵育的比例滴加到片子上，室温避光孵育20-60分分钟为防止蒸防止蒸发，孵育，孵育时最好将片子置于最好将片子置于载玻片染色盒中，玻片染色盒中，载玻玻片染色盒〔片染色盒〔FSR958〕可以〕可以订购三 实验步骤•f. 用含用含0.1% Triton X-100的的PBS洗洗2-4次，次，每次每次约5分分钟。

•g. 盖上盖玻片随后可以直接用盖上盖玻片随后可以直接用荧光光显微微镜进展察看为长期保管，可以在片子自然期保管，可以在片子自然枯燥后封片并于枯燥后封片并于4℃℃避光保管，保管避光保管，保管时间可可长•达达6个月左右个月左右•荧光光显微微镜下察看下察看结果，用果，用绿光激光激发•本卷本卷须知：知：•1 荧光染料均存在淬光染料均存在淬灭问题，，请尽量留意避光，以减尽量留意避光，以减缓荧光淬光淬灭•2 Phalloidin 有一定毒性〔有一定毒性〔LD50 为2 mg/kg〕，〕，1ml Actin-Tracker Green中的中的phalloidin少于少于0.01mg，运用，运用时请留意适当防留意适当防护•3为了您的平安和安康，了您的平安和安康，请穿穿实验服并戴一次性手套操作服并戴一次性手套操作• 4 固各步洗固各步洗细胞要胞要轻，勿使，勿使细胞零落• 5 用用1%Triton X—100 抽提抽提杂蛋白要作蛋白要作预实验，抽提，抽提时间长将破坏将破坏细胞构造，抽提胞构造，抽提时间短背景干短背景干扰大• 6 鬼笔鬼笔环肽标志微志微丝，染色，染色时间勿太勿太长，否那么背景，否那么背景发红。

在没有固定液在没有固定液3.7%甲甲醛—PEMD的情况下，也可以用的情况下，也可以用-20℃℃冷甲醇替代，但是效果冷甲醇替代，但是效果较差•7 细胞充沛胞充沛贴壁壁铺展展时应力力纤维较多，形状挺直反之，多，形状挺直反之，细胞收胞收缩变圆，，应力力纤维弯曲，甚至部分解聚消逝而弯曲，甚至部分解聚消逝而显得得稀少•8每步洗每步洗涤要充沛，并吸去水分〔但也不要干透〕，以免要充沛，并吸去水分〔但也不要干透〕，以免稀稀释下一步的抗体或下一步的抗体或试剂，，这样才干得到明晰的才干得到明晰的荧光光图像 四 作业•微丝察看实验中，1%Triton X—100 处置细胞的作用是什么?•此实验能否能看到微管、中间纤维? •为什么?五 预期结果〔共聚焦效果图〕。