实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质.docx

一、 实验目的1 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法2 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系二、 实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值 大为降 低，制约着马铃薯的开发利用酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题其中多酚氧 化酶是导致马 铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程 度多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等•是自然界中分布极广的 一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化 酚与 02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病 能力研究多酚氧化 酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义因此，检测食品中多 酚氧化酶具有重要意义多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、 pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二 酚氧 化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光 光度计 410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 邻醌+ H2O三、 试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 •试剂：0・1mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.0） ； 0.01 mol/L邻苯二酚；0.1 mol/L磷酸氢二钠；0・1mol/L磷 酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）； 10mmol/L 亚硫酸钠四、 实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0・5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0） 3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再 用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min） 5min,取上清液为多酚 氧化酶 提取液，并量取粗酶液体积2•多酚氧化酶活性测定采用比色法测定将0・5m l邻苯二酚加入2m l磷酸缓冲液（pH 7.0）中，加入0.5m l酶提取 液, 立即于波长 410nm 下测定吸光值， 2min 后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照（注 意空白为： 2.5ml 缓冲液和 0.5mL 邻苯二酚溶液）。

以每分钟吸光度变化 0.01 为 1 个多酚氧化酶活 性单位表 1 多酚氧化酶活性测定磷酸缓冲 液（mL）邻苯二酚（mL）粗酶液（mL）OD4102min 后OD410△ OD410酶活力（U）空白组2.50.50试验组2.0050^4.2组号不同pH的磷酸邻苯二酚(mL)粗酶液(mL)OD4102min 后OD410△ OD410酶活力(U)缓冲液(mL)1pH=4, 2.0mL-052 :pH=5, 2.0mL-r0.5「053pH=6, 2.0mL0.50.54 IpH=7, 2.0mLr0.5 10.55pH=8, 2.0mL＞宓后/ iz缽曲砂砧丘0.5rrr£t0.5表 2pH 对多酚氧化酶活性的影响3多酚 以每克样每分钟内A410增加0.01为1个酶活力单位U△ A410X酶提取液总量(ml) 酶活力(0.01A/gmin )= 0.01反应时间(min)样品鲜重(g)测定时酶液用量(ml)4 酶学特性4.1PH对多酚氧化酶活性的影响室温下在试管中加入已配好的不同pH值的缓冲溶液2・0mL，邻苯二酚0.5ml，多酚氧化酶粗 酶液0.5mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为多酚氧化酶的活性。

以缓冲液 pH值为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活 一 pH 曲线，以确定最适 pH 值试管中加入pH7.0的磷酸盐缓冲溶液2・0mL，以邻苯二酚溶液0・5mL为底物,在不同温度(常温、40、 60C的温度条件)下保温5min后，加入多酚氧化酶粗酶液0・5mL，混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活 性以温度为横坐标，多酚氧化酶活性为纵坐标，作出酶活 一温度曲线，以确定最适温 度温度磷酸缓冲液(mL)邻苯二酚(mL)粗酶液(mL)OD4102min 后OD410△ OD410酶活力(U)室温2.00.50.52.00.50.560 r2.00.50.5表 3 温度对多酚氧化酶活性的影响4.3抑制剂对多酚氧化酶活性的影响将抑制剂抗坏血酸(VC)、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA分别用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液配制成 10mmol/L的溶液，在室温下分别取上述抑制剂2・0mL，以邻苯二酚溶液0.5mL为底物，加入多酚氧化 酶粗酶液0.5mL,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性以抑制类型为横坐标，多酚氧化酶活性为纵 坐标，绘制抑制剂对酶活影响的图形，分析抑制剂对酶活性影响表 4 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响抑W磷酸缓冲液(mL)邻苯二酚(mL)粗酶液(mL)OD4102min 后OD410△ OD410酶活力(U)抗坏血酸2.00.50.5柠檬酸2.00.50.5亚硫酸钠2.0r 0.5 d0.5EDTA2.00.50.5五、注意事项1 、 反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效2、在试验中加入一种酚结合剂--聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用，从而消去酶反应体系中的底物，使PPO活性的测定更接近其真值。

3、 使用分光光度计时要求动作快速、熟练4、加样时，先加缓冲溶液，再加底物邻苯二酚，摇匀，在测量之前最后加酶提取液六、思考题1.本试验中使用到磷酸缓冲液，请问磷酸缓冲液在本试验中的作用？2.试分析不同温度、 pH 对马铃薯多酚氧化酶的影响？3. 谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识参考文献：曹建康，姜微波，赵玉梅编着 .果蔬采后生理生化实验指导 .中国轻工业出版社 ,2007.9. 毛丽梅 邓红，马安德，卢晓翠食品安全综合实习指导 .科学出版社 ,2013.02.104-105李彩霞张芬琴张喜峰赵金梅白生文。