引物设计流程.docx

PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例） 一． 流程图二． 确定模板1. 确定模板来源物种近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟）， 两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板如，扩增鹅PHIP基因选择以 下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼2. 利用 NCBI 得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入NCBI主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如 下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都 可使用）Search搜索范围clearDi弓pls>¥ 莹 ® Tabular, 20 per page. Sorted by Relevance9SUltB： 1 to 20 oM4^> 结果数基因别名rvllfvlO Filters activated. Current oil/ Clear all to show 147 items.riIters: P/lanaqe Filters 树状图^Taxoiomic GroupsDescriptionLocationAliasesName/Gene ID□ PHIPID:55023plec

基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http://www.ncbi・nlm・nih・gov/refSeq/about/亠 MCBI Reference Sequences （RefSeq）田肚『5电鸣nnaintdirwd和血卩朗血皿比of Annotatfid GEnomES独立于注释基因组的参看序列，具有数据库来源，多为实验扩增所得’可靠性高 £只戲皐酹of Annotated GEnomE5： Homo sapiEn弓Annotation血1歸盟106来源于注释 基因组的参考序列，为计算机预测所得』可靠性较低C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）PREDICTED: Mus musculus pleckstrin homology domain interacting protein (Phip), transcript|variant Xlj mRNANCBI Reference Sequence: XM_006511564.2FASTA G 即 hi*D.如需得到该基因所在基因组的序列信息(如扩增启动子区域时)，在基因报告页面上部Genomic regions,transcripts, and products条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组(组装)序列页面。

Genomic regions, transcripts, and productsGo to 厲斯叩诜 det日ibGenomic Sequence: NC_000006.12chromosome 6 reference GRCh38 Prima^ Assembly p^|Go to nucleotide: Glyphic：石 | FA3TA. | GenEi目ilkE.在基因组（组装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可Di Epl 詡丫 Getting e: © FASTAHomo sapiens chromosome 6, GRCh38 Primary AssemblyNCBI Reference Sequence. NC_000006.12Gmn日mnk G『占Qhh二占>gi 1563315592: 070078294-73934419 Hmm sapiens DhromoEurL© 6」GFCh38 Primary Assejiibly呂iici: 0Change regiian ^hov^nWhole sequence '®' Selected region from: 7893-4419to: 79078294UpdateView]3. 整理下载的模板序列Chicken XM_0D354O997.2.txt保存模板时，记录物种名，同时在命名DuCkXMOT5O17&6&.l.txt中添加NCBI登录号便于以后査找Human NM_017924.5.txtIVlus musculuE NIV1_001OS121 &. 1 .txtPHIP.txt _ 械件_ Xenopus tropicalis XM_002936206,2,t„,Zebrish XMj&092970(M.l,txt文件鬥 扁辑让）梧式q 童看却 m（H）＞名称1ATGC...（序列 1）〉名称2ATGC...（序列 2）以此类推三． 寻找保守区域序列乗・bd -记事生文件旧 漏辑⑹ 梧式(Q〕直君[V)年助(H)>Chicken [Gallus gallus]atggg gaggaaaaagat ccagat ccagcggatc 呂 egg 呂 1: gagcg ettgatgaagaaagcctacgagctgagcgtgttgtgcgactgcg tgttccagt at gccagcaccgacatggacaaggtg^tgct'taag保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。

在扩增基因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因因此，在引物设计前需先找出目的序列中的保守区域在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物1. 制作 mega 标准序列A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单File —Load Sequences）,然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment,此时将保存两种格式文件:.dnd和.aln（序列较长时耗时较长，需数分钟）可 ClustalX (1.83)File Edit Alignment Trees Colors Quality HelpMultiple Alignment Mode 〒Font Size: 1 0 〒ChickenHuirLanMouseRat [RattiasCattle|TGGGG|GGAAAAAGA^qAGATVAG|G4TMGG|TG|G|GGAAHGnGGTG|B atggggaggaaaaagatt|agat1cag|gaatca|cga|gag|gga«ga|aggtgaIt ATGGGGAGGAAAAAGATT|AGATfcAG|GAiIl JtGATGAaIgGA«G«AGGTG« ATGGGGAGGAAAAAGATTflAGATflAGfGAATflAlTGATGAAlGGAAHGHAGGTGA|A |tgggg!ggaaaaagattiagatcc|agcgaatc^cbg1tgIg|ggaacc|ga||ggtg||gOutput Guide Tree File:Output Alignment Files:Clustal:B.将以上.aln文件用DAMBE软件打开（File—Open standard sequence file）,注意选择恰当的序列类型。

打开后的文件可直接转存为.meg或.fas格式文件（File—Save or Convert Sequence Format）注1此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为UStandard (Trans：T^ble=1 ]Standard(T p[otein-co(i N on-pratein Nuc. 5 eq.L Amino Acid Seq.陛 Data Anal/sk in McJecuhr Biol-ogy and EvalutiQnFile Edit Alignment Sequences S-eq. Analysis Ph、102030DuckChicken XbiiopusHumanMusZebrishATGTCGTCTCTCAACAACCAGCAC。