使用NCBI查找DNA引物设计BLAST序列比对.doc

最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以便利的找到答案现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（阅历）跟大家沟通一下 BCBI 的使用盼望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！ 我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用： Part one 如何查找基因序列、mRNA、Promoter  Part two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列 Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列 Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性   特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！ 从发帖到现在，很多战友对该帖给与了乐观的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却临时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，感谢各位战友！ 请大家对以下我发表的内容提出自己的意见关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充  First of all，还是让我们从查找基因序列开头  第一部分 利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、启动子（Promoter）  下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例叙述一下简略的操作步骤  1． 打开Map viewer 页面， 网址为： 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。

操作完毕如图所示：  2．点击“GO”消失如下页面：  3． 在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框， 在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 消失下图：    说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本全都，不影响大家商量分析序列现在普遍接受的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列我也推举大家使用这个序列4．点击上述三条序列第一条序列（即 reference）对应的"Genes seq"，消失新的页面，页面下方为：   5．点击上图消失的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，结果如图所示：  先对上面这张图做点简要的说明，在 Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下拉式选择菜单，默认的为 FASTA 格式，还有一个是 GenBank 格式我推举大家选择 GenBnak格式，由于这个格式供应了很多该基因的信息，而 FASTA格式只有基因序列。

 6．在 Sequence Format 后选择 GenBank，然后点击下面的 Display，目的基因的相关信息和序列就消失在眼前了点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范） ：   在上述打开的网页中，你可以看到基因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息 你会看到:  mRNA  join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 这代表了从基因的 3598位开头就是转录区了， 即我们常说的 mRNA 片断， 由于内含子的存在，所以 mRNA 在DNA 序列上分成了几段 CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970) CDS 代表编码序列，即蛋白编码区是从 3660 开头的（ATG） ，由于剪接作用所以 CDS 区也是不连续的  说到这里，可能很多伴侣都已经明白了 promoter 即启动子区域在哪里了但我还是再唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是猜想它的大体位置，如果你要商量 promoter 区的话，建议你选择转录起始位点前的 2000个碱基进行商量，一般默认的是这样。

当然你如果觉得长度太长不好商量的话，也可以只研究-1000 到0这一千个碱基，由于一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内  这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很多，但我个人比较喜爱，由于它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域盼望大家可以发帖沟通，让我们把 NCBI 用的更好！   6  其次部分  如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人类的 IL6 为例） 1．进入NCBI 主页： 在 search 后面选择 Gene，在 for 后面填写需要查找的基因的名字如图所示：   消失了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一致，依据每个序列的介绍专心选择你的目的基因上图中我需要的 IL6 是标号为2的序列   2.1  查找 cDNA 序列 2.1.1  点击Order cDNA clone, 消失目的页面如图所示：2.1.2  点击Clone Sequence 后面的链接即可得到cDNA 序列。

点击后如图所示（只抓取其中一部分） 2.2  查找 mRNA、蛋白序列 回到步骤 1 点击“Go”之后消失的页面，点击目的基因的名字，消失以下页面 (只抓取相关部分)： 页面的下半部分，即可以猎取 mRNA和蛋白序列的部分：  找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA and Protein ”区可以让我们找到连续的编码 mRNA 序列和蛋白序列在 mRNA and Protein下面有两个序列代码（中间划有一个箭头） ，这代表了 mRNA序列和蛋白序列分别点击就可以得到相应的序列页面点击后如图所示，mRNA 序列：  NCBI Reference Sequences (RefSeq)的其次个板块是 Reference assembly，它下面显示的是 Genomic ，点击 Genomic 下面Reference assembly 对应的 Genbank 或 FASTA 即可消失编码的 DNA 序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有 5‘非编码区） 一步就不做贴图演示了吧，      呵呵 这样我们就可以找到基因的 cDNA 序列、连续的编码 mRNA 序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA 序列了。

信任这些操作对很多战友还是有用的  如果大家有更好的方法，欢迎发帖沟通！  友情提示：在 NCBI 里打开的每一个页面都会给我们供应大量的信息，大家不妨好好看看，可能会有令我们惊喜的收获！  最后唠叨一句： 最近我实验比较忙， 只能在深夜发帖， 可能要过几天再发第三部分[Part three 运用STS 查找已经公布的引物序列]，盼望“期待下集”的伴侣可以理解第三部分 运用STS 查找已经公布的引物序列 STS，序列标签位点（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA 序列（200－500 个碱基对），这种序列在染色体上只消失一次，其位置和碱基挨次都是已知的在PCR 反应中可以检测处STS 来，STS 适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置以上内容基本是STS 的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS 数据库查找引物的一点阅历还是使用人的IL6 基由于例，呵呵1． 打开 NCBI 主页，在 Search 后面的下拉菜单选择 UniSTS，在 FOR 后面填写目的基因 操作完毕如图所示 这是你会发现 NCBI 又供应了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。

2．依据物种、目的引物所在染色体的位置等选择相应序列（可能不只一个） ，点击 下面以点击第一个进入的画面为例   你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp） 下面还有很多相关的信息…… 3．点击GeneBank Accession 后面的代码，进入下一个页面  啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中 Primer A 是前引物序列，Primer B 则是后引物序列，并且给出了他们在 DNA 序列中的位置有爱好的伴侣可以在序列中找一下，是可以找到的， 不过要注意，PCR 是双链扩增，在序列中可以直接找到的是 Primer A 的原序列 和 Primer B的互补序列  在步骤二里面我只点开了一个序列，连续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不过这要你自己渐渐发掘了  这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道，有用程度不是很高，但如果这里面恰好有你想 P 的片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了  如果想寻找引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省时间，牢靠性又强  如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话， 那就自己设计吧， 建议使用 Primer 5 和 Oligo。

引物设计的简略内容我在这里就不多说了，推举两个帖子给大家看一下，第一个是本版版主 liuzeyi2002 发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的  第四部分 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性 提到序列比对，绝大多数战友都会想到 BLAST，但 BLAST 的使用确实又是一个很大的难题， 由于他的功能比较强悍， 里面涉及到的知识比较多， 而且比对结束后输出的结果参数 （指标）又很多如果把 BLAST 的使用简略的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得 BLAST 的使用 所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下 BLAST 的使用， 也算是 BLAST 的入门课程吧 请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了1．打开BLAST 页面， 打开后如图所示： 对上面这个页面进行一下必要的介绍：  BLAST 的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。

信任大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是 BLAST 的三条途径  第一部分 BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面  其次部分 Basic BLAST 包含了 5 个常用的 BLAST，每一个都附有简短的介绍  第三部分 Specialized BLAST 是一些特别目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，这个时候你就需要在 Speciali。