实验八细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记ppt课件.ppt

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色实验原理• Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色  Mito-Tracker Green为采用Molecular Probes公司的carbocyanine进展了荧光标志的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针和rhodamine 123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位实验原理•Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色    Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进展了荧光标志的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标志中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进展荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性1.1.实验实验目的目的 •掌握荧光显微镜任务的原理•了解细胞器在细胞内的分布•了解荧光染料的运用方法Lyso-Tracker Red任务液的配制：•a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例参与到细胞培育液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使•最终浓度为50-75nM。

例如取1μl Lyso-Tracker Red参与到20ml或13.33ml细胞培育液或适当的溶液(例如含钙镁离子的•HBSS)中•2. 溶溶酶酶体的体的荧荧光光标标志：志：•a. 去除去除细细胞培育液，参与步胞培育液，参与步骤骤1配制好的并配制好的并28℃℃预预温育温育的的Lyso-Tracker Red染色任染色任务务液，与液，与细细胞胞28℃℃共孵育共孵育30分分钟钟•b. 去除去除Lyso-Tracker Red染色任染色任务务液，参与液，参与500微升微升预预温温的新的新颖颖的的细细胞培育液或胞培育液或PBS漂洗•c. 取出盖玻片，在取出盖玻片，在载载玻片上滴一滴玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣，将盖玻片反扣在在载载玻片上，玻片上，荧荧光察看光察看•d. 用用荧荧光光显显微微镜镜或激光共聚焦或激光共聚焦显显微微镜进镜进展察看此展察看此时时可可察看到溶察看到溶酶酶体呈亮堂的体呈亮堂的强强荧荧光染色假光染色假设设染色效果欠佳，染色效果欠佳，可以提高可以提高Lyso-Tracker Red染色任染色任务务液中液中Lyso-Tracker Red的的浓浓度或在引荐的度或在引荐的时间时间范范围围内适当延伸染色内适当延伸染色时间时间。

运用阐明：•1. Mito-Tracker Green储存液的配制：•用无水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至终浓度为1mM配制后可以-20℃或更低温度避光保•存•2. Mito-Tracker Green任任务务液的配制：液的配制：•a. 取少量取少量1mM Mito-Tracker Green储储存液按存液按照照1:5000-1:50000的比例参与到的比例参与到细细胞培育液胞培育液或适当的溶液或适当的溶液(例如含例如含钙镁钙镁离子的离子的•HBSS)中，使最中，使最终浓终浓度度为为20-200nM例如取1μl Mito-Tracker Green参与到参与到50ml或或5ml细细胞培育液或适当的溶液胞培育液或适当的溶液(例如含例如含钙镁钙镁离子的离子的HBSS)中混匀后即中混匀后即为为Mito-Tracker Green任任务务液HBSS with Ca2+ & Mg2+ (C0219) 可以可以向碧云天向碧云天订购订购•b. Mito-Tracker Green任任务务液运用前需液运用前需28℃℃预预温育。

温育•注：任注：任务务液中液中Mito-Tracker Green的的浓浓度可以根据度可以根据实实践情况践情况进进展展适当适当调调整为为降低背景，在染色效果可以接受的范降低背景，在染色效果可以接受的范围围内，建内，建议议尽量运用尽量运用较较低低浓浓度的度的Mito-Tracker Green•3. 线线粒体的粒体的荧荧光光标标志：志：•a. 去除去除细细胞培育液，参与步胞培育液，参与步骤骤2配制好的并配制好的并28℃℃预预温育的温育的Mito-Tracker Green染色任染色任务务液，与液，与细细胞胞28℃℃共孵育共孵育15-45分分•钟钟•b. 去除去除Mito-Tracker Green染色任染色任务务液，参与液，参与500微升微升28℃℃预预温育温育的新的新颖细颖细胞培育液或胞培育液或PBS漂洗•c. 取出盖玻片，在取出盖玻片，在载载玻片上滴一滴玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在，将盖玻片反扣在载载玻片玻片上，上，荧荧光察看•d. 用用荧荧光光显显微微镜镜或激光共聚焦或激光共聚焦显显微微镜进镜进展察看此展察看此时时可察看到可察看到线线粒体呈亮堂的粒体呈亮堂的强强荧荧光染色假光染色。

假设设染色效果欠佳，可以提高染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色任染色任务务液中液中Mito-Tracker Green的的浓浓度或在度或在引荐的引荐的时间时间范范围围内适当延伸染色内适当延伸染色时间时间1 1 翻开可将光和激翻开可将光和激发发光光源光光源〔 〔预热预热1010分分钟钟〕 〕2 2遮光板遮住激遮光板遮住激发发光光3 3 选择选择“1“1〞，在可〞，在可见见光下，光下，聚焦，察看明晰聚焦，察看明晰图图像，再像，再调调到高倍到高倍镜镜下，微下，微调调至明晰至明晰4 4 关掉可关掉可见见光光源，翻开遮光光源，翻开遮光板，光板，让让激激发发光透光透过过5 5 选择选择“G“G〞察看〞察看红红色色荧荧光光6 6 选择选择“B“B〞察看〞察看绿绿色色荧荧光光。