蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说ppt课件.ppt

项目七项目七食品中蛋白质及氨基酸态氮的测定食品中蛋白质及氨基酸态氮的测定1.【学习目标学习目标】v1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换算掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换算v2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术掌握凯氏定氮装置的搭建技术v3、掌握蛋白质的测定技术掌握蛋白质的测定技术2【基础知识基础知识】v1、蛋白质及氨基酸概述、蛋白质及氨基酸概述v蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、、H、、O、、Nv一般来说，一般来说，pro的平均含氮量为的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于，既一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值份蛋白质，此数值称为蛋白质系数称为蛋白质系数v所以在用凯氏定氮法定量所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮时，将测得的总氮%乘上乘上pro的换算系数的换算系数K=6.25即即为该物质的为该物质的pro含量v注意：注意：v①①含含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志v②②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，，花生为花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆及其制品为，大豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为；硬果类为5.30；牛乳及其制品为；牛乳及其制品为6.38。

32、原理、原理v蛋白质是含氮的有机化合物食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋蛋白质是含氮的有机化合物食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的收后以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量v氨基酸～氨基酸～HCl～～Nv〖〖注意注意〗〗v此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro43、适用范围、适用范围v国家标准第一法国家标准第一法v适用于各种食品中蛋白质的测定适用于各种食品中蛋白质的测定54、任务分解、任务分解v任务一：湿法消化任务一：湿法消化v任务二：碱法蒸馏任务二：碱法蒸馏v 硼酸吸收硼酸吸收v任务三：盐酸滴定任务三：盐酸滴定v任务四：数据记录与计算任务四：数据记录与计算6任务一：湿法消化任务一：湿法消化v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：7子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备试剂试剂作用作用硫酸铜硫酸铜a催化作用：加速有机物的氧化分解。

催化作用：加速有机物的氧化分解b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾硫酸钾提高溶液沸点，从而加快有机物分解提高溶液沸点，从而加快有机物分解 浓硫酸浓硫酸氧化作用：有机物质氧化分解为氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和和CO28子任务子任务2：样品预处理：样品预处理固体试样固体试样 0.2~2g半固体试样半固体试样 2~5g液体试样液体试样 10~25g样品充分混匀样品充分混匀直接消化直接消化9子任务子任务3：样品称量、消化：样品称量、消化1.000g1.000g奶粉奶粉0.2g0.2g硫酸铜硫酸铜6g6g硫酸钾硫酸钾20mL20mL浓硫酸浓硫酸玻璃珠玻璃珠小火加热炭化小火加热炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止轻摇轻摇 大火加热大火加热保持瓶中液体微沸保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明至蓝绿色澄清透明继续加热继续加热0.5～～1h冷却冷却加加20mL水水冷却冷却同时做试剂空同时做试剂空白试验白试验10思考思考v1 1、玻璃珠的作用？、玻璃珠的作用？v2 2、小漏斗的作用？、小漏斗的作用？v3 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？v4 4、开始消化时为什么用小火？、开始消化时为什么用小火？v5 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？、消化液不易澄清透明时可采用的措施？v6 6、消化完成时的产物？、消化完成时的产物？v7 7、加、加20mL20mL水的作用？水的作用？v8 8、空白试验的目的？、空白试验的目的？11任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：10mL100mL 3只只12子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v水蒸气发生器：水蒸气发生器：v装水至装水至2/32/3处，加入数粒玻璃珠，加处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂甲基橙指示剂数滴及硫酸数数滴及硫酸数mlml，使水呈微红，使水呈微红色色→→按上图所示搭好装置按上图所示搭好装置v〖〖注意注意〗〗v①①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。

装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理v②②在蒸汽发生瓶中要加在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂甲基橙指示剂数滴及硫酸数数滴及硫酸数mlml以使其始终保持酸性，以防以使其始终保持酸性，以防水中氨蒸出水中氨蒸出13子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v试剂：试剂：v40%40%氢氧化钠氢氧化钠v20%20%硼酸溶液硼酸溶液v混合指示剂混合指示剂v1 1、、1 1份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（1g/L1g/L）与）与5 5份溴甲酚绿乙醇溶液（份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L1g/L）临用时混合）临用时混合 酒红色酒红色→→绿色绿色v2 2、、2 2份甲基红乙醇溶液（份甲基红乙醇溶液（1g/L1g/L）与）与1 1份亚甲基蓝乙醇溶液（份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L1g/L）临用时混合）临用时混合 紫红色紫红色→→绿色绿色14子任务子任务2：碱化蒸馏、硼酸吸收：碱化蒸馏、硼酸吸收v10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液 100mL100mL三角瓶三角瓶 加加1 1～～2 2滴混合指示剂滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角冷凝管下端插入三角瓶液面下瓶液面下 准确吸取准确吸取10mL10mL试样试样 由小玻杯流入反应室由小玻杯流入反应室 少量水洗涤小漏斗少量水洗涤小漏斗 盖紧玻璃塞盖紧玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液 倒入小玻杯倒入小玻杯 提起玻塞使其缓慢流入反提起玻塞使其缓慢流入反应室应室 立即塞紧玻璃塞立即塞紧玻璃塞 加水于小玻杯防漏气加水于小玻杯防漏气 通蒸汽通蒸汽 颜色变化时开始计颜色变化时开始计时蒸馏时蒸馏5min 5min 移动接受瓶使液面离开冷凝管下端移动接受瓶使液面离开冷凝管下端 再蒸馏再蒸馏1min 1min 用少量水冲用少量水冲洗冷凝管下端外部洗冷凝管下端外部 取下接收瓶取下接收瓶15 v〖注意〗v①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色16v加碱加碱足量的判断：足量的判断：v溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀v原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑色的氧化铜沉淀。

的情况下会分解成黑色的氧化铜沉淀v如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止生上述现象为止17v②②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出一是加样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象v③③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 v④④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏吸收液温度不应超过冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏吸收液温度不应超过40℃40℃，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。

18v⑤⑤检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法原理检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法原理:NH4+或或NH3遇奈氏试剂会反应遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应v⑥⑥在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽, ,否则会发生倒吸否则会发生倒吸v⑦⑦蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1 1分钟，将附着在尖端的吸收分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸则吸收液将发生倒吸v⑧⑧所用的试剂溶液所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制必须用无氨蒸馏水配制19任务三：盐酸滴定任务三：盐酸滴定v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：v25mL25mL酸式滴定管酸式滴定管1 1套套v试剂试剂v0.0500mol/L HCL0.0500mol/L HCL标准溶液标准溶液20子任务子任务2：盐酸滴定：盐酸滴定v接收瓶接收瓶 以以HCL标准滴定液滴定标准滴定液滴定 灰色终点灰色终点 记录记录VHcl（（1 1）硼酸吸收液的颜）硼酸吸收液的颜色色（（2 2）吸收氨气后的硼）吸收氨气后的硼酸吸收液的颜色酸吸收液的颜色（（3 3）盐酸滴定终点）盐酸滴定终点的颜色的颜色21v〖〖注意注意〗〗v①①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色混合指示剂在碱性溶液中呈绿色, ,在中性溶液中呈灰色在中性溶液中呈灰色, ,在酸性溶液中呈红色。

在酸性溶液中呈红色v②②酸式滴定管的正确使用酸式滴定管的正确使用22项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据内容内容1 12 23 3 空白空白样品质量样品质量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V终终 / / mLmL消耗的体积消耗的体积V V1 1 /mL /mL吸取消化液体积吸取消化液体积V V3 3 /mL/mL蛋白质含量（蛋白质含量（g/100gg/100g））平均值（平均值（g/100gg/100g））两次测定之差两次测定之差/ /平均值平均值精密度精密度CyCy （（g/100gg/100g）） F F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.386.38任务四、数据记录与计算任务四、数据记录与计算23v有效数字：有效数字：v蛋白质含量蛋白质含量≥1 g/100 g时，结果保留三位有效数字时，结果保留三位有效数字v蛋白质含量＜蛋白质含量＜1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。

时，结果保留两位有效数字v精密度：精密度：v在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%（（g/100g））24小结小结步骤步骤反应前后颜色变化反应前后颜色变化湿法消化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→→加硫酸炭化黑色加硫酸炭化黑色→→消化消化后红棕色后红棕色→ → 棕褐色棕褐色→→消化终点蓝绿色消化终点蓝绿色/ /墨绿色墨绿色→→淡蓝色（冷淡蓝色（冷却后溶液）却后溶液）碱化蒸馏碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫红色紫红色→→绿色绿色盐酸滴定盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色蓝紫色25v凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。

定结果为粗蛋白质含量v若要测定样品的蛋白氮若要测定样品的蛋白氮, ,则需要向样品中加入则需要向样品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶液溶液, ,使其最终浓度为使其最终浓度为5%,5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量, ,进进一步计算出蛋白质含量一步计算出蛋白质含量: : 蛋白氮蛋白氮= =总氮总氮- -非蛋白氮非蛋白氮26任务五：试验器具的清洗整理任务五：试验器具的清洗整理27【【拓展学习拓展学习】】v1、其他蛋白质测定方法、其他蛋白质测定方法——分光光度法分光光度法v（（1）原理）原理v食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在在pH 4.8 pH 4.8 的乙酸钠的乙酸钠- -乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-3,5-二乙二乙酰酰-2,6--2,6-二甲基二甲基-1,4--1,4-二氢化吡啶化合物在波长二氢化吡啶化合物。

在波长400nm400nm下测定吸光度值，与标准下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量v（（2）特点）特点v快速、污染少、操作简单、省时快速、污染少、操作简单、省时v 国家标准测定蛋白质第二法国家标准测定蛋白质第二法28v2、改良式凯氏装置、改良式凯氏装置江江苏畜牧畜牧兽医医职业技技术学院学院泰州市泰州市质监局局29v3、自动凯氏定氮法、自动凯氏定氮法1.1.原理原理 同常量凯氏定氮法同常量凯氏定氮法2.2.主要仪器主要仪器 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置动数字显示装置 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组合成的消化炉消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组合成的消化炉3、试剂、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同4、优点、优点灵敏、准确、快速以及用量少灵敏、准确、快速以及用量少30l准准确确称称取取某某乳乳粉粉样样品品0.8000.800克克，，经经凯凯氏氏法法消消化化定定容容至至100ml100ml，，移移取取5ml5ml消消化化液液进进行行蒸蒸馏馏，，用用20ml20ml硼硼酸酸吸吸收收，，再再用用0.05000mol/lHCl0.05000mol/lHCl滴滴定定，，结结果果消消耗耗5.00ml5.00ml，，试试计计算该乳粉的蛋白质含量？算该乳粉的蛋白质含量？l试试述述蛋蛋白白质质测测定定中中，，样样品品消消化化过过程程所所必必须须注注意意的的事事项项，，消消化化过过程程中中内内容容物物颜颜色色发生什么变化？为什么？发生什么变化？为什么？l样样品品经经消消化化进进行行蒸蒸馏馏前前，，为为什什么么要要加加入入氢氢氧氧化化钠钠？？这这时时溶溶液液发发生生什什么么变变化化？？为为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？31v子项目二子项目二v14酱油中氨基酸态氮的测定酱油中氨基酸态氮的测定（（GB/T 5009.39-2003 ））32任务一：相关仪器设备及试剂的准备v仪器设备：碱式滴定管、移液管、200mL烧杯、100容量瓶、酸度计、磁力搅拌器、滴定台v试剂：浓度为36%中性甲醛；氢氧化钠标准溶液：0.05mol/L（需临用前标定）33任务二：成分分析任务二：成分分析1.1.原始记录表格的设计原始记录表格的设计34项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据样品滴定次样品滴定次数数加甲醛前加甲醛前加甲醛后加甲醛后空白滴定空白滴定V2V2初读数初读数末读末读数数消耗体消耗体积积初读数初读数末读数末读数消耗消耗体积体积V1V11 12 2氨基酸态氮含量氨基酸态氮含量X X（（g/100mLg/100mL））= =平均值平均值精密度精密度352.2.样品中游离酸中和样品中游离酸中和v吸取5mL试样→100mL容量瓶中→定容→混匀后吸取20.0mL→200mL烧杯→加水60mL→插入酸度计的指示电极和参比电极→开动磁力搅拌器→0.050mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2→记录消耗体积363.3.滴定样品中氨基酸酸基含量滴定样品中氨基酸酸基含量v上述烧杯→加入10mL甲醛溶液→混匀→再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2→记录消耗体积V137【【拓展拓展】】v本法原理：v氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定它的羧基。

当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量38394.4.空白试验空白试验v取80mL蒸馏水→200mL洁净烧杯→先用氢氧化钠标准溶液滴定pH8.2→加入10.00mL中性甲醛溶液→用氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）滴定至pH9.2→记录消耗体积V2405.5.数据处理数据处理v精密度：精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%41任务三：试验器具的清洗整理任务三：试验器具的清洗整理42。