大学论文 马铃薯Y病毒的核酸点杂交检测试剂盒的研制.pdf

福建农林大学硕士学位论文马铃薯Y病毒的核酸点杂交检测试剂盒的研制姓名：祝雯申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：谢联辉2001.5.1福建农林大学硕士学位论文摘要根据已报道的马铃薯Y 病毒( P o t a t ov i r u sY ，P ．V Y ) 分离物C P 基因序列，设计简并引物，利用R T —P C R 扩增了P V Y 坏死株系C P 基因的部分片段核酸序列分析表明，该序列含有4 l3 个核苷酸，与北京P V Y 分离物同源性为9 7 ．8 ％，与法国P V Y “以及加拿大P V Y o 同源性均为9 7 ．6 ％，与美国P V Y 的分离物同源性为9 7 ．1 ％通过P C R 方法制备D I G 标记的P V Ye D N A 探针，利用该探针研制了核酸点杂交检测试剂盒，该试剂盒在国内首次采用不需研磨样品的黄原酸钾( P E X ) 方法快速提取核酸，此方法可有效避免植物组织内R N A 酶对病毒R N A 的降解{ 比较该试剂盒、R T ．P C R 方法和E L I S A 方法的灵敏度，试剂盒的灵敏度( 2 0 0 n g 病叶中的病毒) 明显高于E L I S A 方法( 灵敏度为1 0 0 u g 病叶中的病毒) ，虽低于R T —P C R 方法( 灵敏度为8 n g 病叶中的病毒) ，但已满足检测的需要，而且该试剂盒不需要特殊的仪器。

与国内同类报道相比，该试剂盒具有灵敏、简单、快速、经济的优点，适合于～般的实验室进行大量马铃薯脱毒苗的检、测工作斗、、．／关帆：rY 幅D I G 标≥c D N A 探针，黄原酸钾< 秭了7检淋7／／福建农林大学硕士学位论文A b s t r a c tP o t a t op i r U SY n e c r o t i cs w a i nw a sp u r m e d , t h e nv i r u sR N Aw a se x t r a c t e d ．T h ep a af i a 留m e n to fC Pg e n ew a sa m p l i f i e db yR T - P C Ra n ds e q u e n c e d ．R e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e q u e n g es h a r e si d e n t i f i e so f m o r e9 7 ％w i t hB e i j l n gi s o l a t e , U Si s o l a t e , P V Y S F r a n c ei s o l a t e , a n d 唧i s o l a t e ．T h e s ec l o n e sw e r eu s e dt op I 耳l a l ．em o l e c u l a rd e t e c t i o np r o b e sb yl a b e l l i n gw i t hd i g o x i g e n i r rN u c l e i ca c i d ss p o th y b r i d i z a t i o nk i tf o rt h ed e t e c t i o no fp o t a t ov i r u sYk i ti sm a d ew i t hd i g o x i g e n i n - l a b e l l e dc D N Ap r o b e ．N u c l e i ca c i d sa r ce ) 由矗删r a p i d l yw i t hab u f f e rc o m i n i n gP o t a s s i u mE t h y lX a n t h o g e n a t e ( e E X ) w i t h o u tt i s s u eh o m o g e n i z a t i o n ．n l em e t h o do fn u c l e i ca c i de x t r a c t i o nw i t hP E XW “ d Sf i r s t l yu s e df o rt h ed e t e c t i o no f p l a n tv i r u s e si ne h i n aC o m p a r i n g t h es e n s i t i v i t y o f t h e k i t w i t h t h e m e t h o d o f R l ' _ P C R a n d E L I S 八t h es e n s i t i v i t y o f d e t e c t i o n i n I c a v e s i s a b o u t l O O u g b y E L I S A a n d d o w n t o8 n gb yR T - P C I LT h es e n s i t i v i t yo f t h ek i ti sa b o u t2 0 0 r i g ．T h o u g ht h es c a ：l s i t i v i t yo ft h ek i ti sl o w e rt h a no f R T - P C R , t h ed e t e c t i o no f P v Yc a nb ed o n eb yt h ek i tw i t h o u ts p e c i a la p p a r a t u s ．S ot h ek i ti sau s e f u lt o o lf o rt h er O t l 妇t e s 吐n 吕a n ds e l e c t i o no f v i r u s - f r e ep o t a t o e s ，e s p e c i a U yw h e nal a r g en u m b e ro f s a m p l e sa r ed e t e c t e d ．K e y w o r d s ：P o t a t o v i r u s Y ，P E X ，D i g o x i g e n i n - l a b e l l e d e D N A p r o b e s ，d e t 鳅i o r l福建农林人学硕士学位论文1 ．前言马铃薯( S o l a n u mt u b e r o s u mL ．) 是继小麦、水稻、和玉米之后的第四大粮食作物，其单位面积和单位时间的产量均高于其它三种作物。

由于马铃薯既可作粮食，又可作蔬菜，同时还是食品工业、饲料工业、轻工业、化学工业的重要原料，因此马铃薯的生产非常重要，尤其在发展中国家目前，我国马铃薯种植总面积约3 ．0 X 1 0 6 h m 2 ，总产量约为5 ．5 0 ．7 ．0 0 ×1 0 ”k g ，是世界最大的马铃薯生产国但我国的马铃薯平均亩产不足1 0 0 0 k g ，不到发达国家平均亩产2 5 0 0 k g 的l ／2( 马异泉，1 9 9 8 ) 危害我国马铃薯生产的主要病害是病毒病、晚疫病、环腐病、黑茎病、青枯病，其中马铃薯病毒病发生最普遍1 ．1 马铃薯病毒病的发生和危害当马铃薯由其原产地拉丁美洲的智利和秘鲁传到世界各地种植后，发现在许多地方马铃薯发生退化现象，表现为产量逐年降低，同时植株变得矮小，并有花叶和卷叶等异常现象种薯退化问题一直限制着我国大多数省份马铃薯栽培面积的扩大和产量的提高，因此解决退化问题是发展马铃薯生产的关键关于马铃薯退化的科学解释主要有病毒侵染学说和高温诱发学说我国科研工作者从1 9 5 3 年开始研究我国马铃薯退化问题，认为无病毒马铃薯对地理气候条件的反应与自然带毒种薯完全不同无病毒的马铃薯不发生退化，但高温对带毒种薯的退化起着决定性的作用，而生长在低温条件下的马铃薯可以受病毒侵染而受害不明显，因此马铃薯病毒是引起马铃薯退化的根本原因( 田波等，1 9 8 0 ) 。

因为马铃薯在种植过程中易感染病毒，世代种植，病毒病害逐年加重，最终失去使用价值，所以马铃薯病毒是影响我国马铃薯生产持续发展的一个重要因素福建省地处亚热带，气候温暖，适合于病毒病的发生和流行，因此马铃薯种质退化问题十分严重( 蔡建生，1 9 9 7 ) 福建农林大学硕士学位论文调查表明我省从北方引种的马铃薯第二年就减产2 0 —5 0 ％，第三年减产5 0 一8 0 ％，甚至绝收( 谢联辉，1 9 6 3 ) 迄今已报道有2 0 余种病毒和1 种类病毒可侵染马铃薯( 谢联辉等，1 9 9 9 ；v a n R e g e n m o r t e le ta 1 ．，2 0 0 0 ) ( 见附表1 ) 其中，在许多国家分布普遍而且危害严重的是马铃薯Y 病毒( P o t a t ov i r u sY ，P V Y ) 、马铃薯x 病毒( P o t a t ov i r u sX ，P V X ) 、马铃薯A 病毒( P o t a t ov i r u s A ，P V A ) 、马铃薯卷叶病毒( P o t a t ol e a f r o l lv i r u s ，P L R V ) 、马铃薯S 病毒( P o t a t ov i r u sS ，P V S ) 和马铃薯纺锤块茎类病毒( P o t a t os p i n d l et u b e rv i r o i d ，P S T V d ) ( H a d i d ie ta 1 ．，1 9 9 8 ) 。

在我国，P V Y 、P V X 、P L R V 、P V S 和P S T V d 是马铃薯的主要病原( 李汝刚等，1 9 9 2 ) 它们单独侵染或复合侵染导致马铃薯产量和质量的显著下降，因此对它们进行检测是无病毒种薯生产的重要措施马铃薯Y 病毒是引起马铃薯退化的最重要的病毒之一，它广泛分布于几乎所有马铃薯种植区( W a r de ta 1 ．，1 9 9 1 ) ，所以P V Y 的检测和防治对马铃薯生产具有重要意义1 ．2 马铃薯Y 病毒( P o t a t ov i r u sY ，P V Y )P V Y 是马铃薯Y 病毒科( P o 钞v i r i d a e ) ，马铃薯Y 病毒属( P o t y v i r u s )的模式成员P V Y 可导致马铃薯退化，降低马铃薯产量，严重的减产可达5 0 ．8 0 ％，减产程度随马铃薯品种和病毒株系而有所不同( 谷爱仙，1 9 9 8 ) 尤其当和其它马铃薯病毒，如P V A 、P V X 和P V S 等复合侵染时，病情加重，造成更大的损失我国由北向南马铃薯的P V Y 带毒率依次增高，以致于我国中部和南部地区不能自行留种，必须从东北、内蒙古等发病轻的地区调种，大大增加生产的成本。

1 ．2 ．1 马铃薯Y 病毒生物学特性寄主范围较广，除能侵染马铃薯外，还可侵染西红柿、烟草、辣椒、矮牵牛等6 0 多种植物( D e l q a d o ．S a n c h e ze ta 1 ．，1 9 7 0 ) ．’}1：，福建农林大学硕士学位论文传播P V Y 可由汁液接种传播，也可由茎和块茎髓部嫁接传播、兔丝子传播和蚜虫传播自然传播主要靠蚜虫，可由2 5 种以上的蚜虫以非持久性方式传播，桃蚜( M y z u s p c r s i c a c ) 是最有效的传播介体，饲毒时间3 0 s e c 到5 m i n ，接种时间约3 0 —6 0 s e c 到2 4 h ( 张成良等，1 9 9 4 ) 症状P V Y 在马铃薯上的症状随病毒株系和栽培品种而有很大的变化，其严重程度从轻微症状( 有些马铃薯品种甚至没有症状) 到严重坏死有些品种受某些株系侵染时造成轻微花叶和粗缩症状，而许多品种的反应是皱。