口服DNA疫苗pcDNA31flk1n17抗大肠癌血管生成的实验研究.pdf

昆明医学院研究生学位论文独创性声明本人郑重声明:本学位论文是我本人在导师指导下，进行学位课题研究工作基础上所取得的成果论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人或其他机构已经发表或撰写过的研究论文或成果对本研究和论文做过贡献的同道我均在文后作了说明并表明学位论文资料若有不实之处本人承担一切相关责任论文作者 ( 签名) o t } l 月 / 6 F,昆明医学院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解昆明医学院有关保留、 使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文复印件和电子版;允许论文被查阅和借阅: 学校可公布论文的全部或部分内容 ( 确属保密内容已注明，并在解密后遵守此规定) ;学校可采用影印、缩印或其他手段保存本学位论文八 r \学位论文作者 ( 签名) : 、 、 了 月 r(}日旨 导老师 ( 签名) :夕们心 年石 月昆明医学院博 t : 研究生学位论文口 服D N A疫苗p c D N A 3 . 1 + / fl k - 1 (,l _7)抗大肠癌血管生成的实验研究中 文 摘 要目 的: 制备抗 肿瘤血管生 成口 服D N A疫苗p c D N A 3 . 1 + / fl k - 1 ( 卜 7 ) ， 研究该疫苗抗B A L B / c 小鼠大肠癌生长和转移的作用，并探讨其可能的作用机制。

方法: 1 . 提取B A L B / c 胎鼠总R N A , 采用R T - P C F技术扩增出V E G F R 2 胞外c D N A全长序列fl k - I (n )- 7 ) ，以 质粒p c D N A 3 . 1 ( + ) 为载体， 构建成重组质粒p c D N A 3 . I + /fl k - 1 ( 卜 7 ) ， 经脂质体介导将其转染C O S - 7 细胞， 并用W e s t e rn b l o t 方法检测其蛋白 表达 2 . 将p c D N A 3 . 1 + / 17 k - 1 (n I - 7 ) 转化感 受态 减毒 沙门氏 菌S L 3 2 6 1 ， 制备 成以S L 3 2 6 1为载体的口服D N A疫苗3 . 将小鼠分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组，两周内各口服接种三次后，用C T 2 6 细胞建立结肠癌皮下动物模型，观察小鼠的中位生存期 4 . 将小鼠分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组， 两周内各口服接种三次后， 用C T - 2 6 细胞建立结肠癌皮下动物模型; 流式细胞仪分别于接种疫苗前、 接种疫苗后、接种C T - 2 6 细胞后测血液C D 3 + 值和C D 8 + 值;接种C T 2 6 细胞2 8 天后处死全部小鼠，取出肿瘤，称重，测体积，免疫组织化学法计数肿瘤微血管密度， 透射电镜观察细胞超微结构变化， 观察疫苗对小鼠C T - 2 6 细胞皮下肿瘤的抑制作用。

5 . 将小鼠分为疫苗组、空质粒组和生理盐水组，两周内各口 服接种三次后，从脾脏下极包膜内接种C T - 2 6 细胞，建立结肠癌肝脏转移动物模型;记录小鼠的体重变化;流式细胞仪分别于接种疫苗前、 接种疫苗后、 接种C T - 2 6 细胞后测血液C D 4 4 v 值:接种C T - 2 6 细胞1 5 天后处死全部小鼠，取出肝脏和脾脏， 称重， 测体积， 病理学检查，体视学计数肝脏肿瘤转移灶个数，观察疫苗对小鼠肝转移的抑制情况结果: 1 . 成功地克隆出V E G F R 2胞外c D N A序列fl k - 1 (n t -7 ) ; 构建成重组质粒p c D N A 3 . I + / fl k - 1 (n ( -7 ) , 测序证实与 G e n B a n k公布的小鼠V E G F R 2胞外序列一R,W e s t e r n b l o t 法检测到fl k - 1 (n 1 -7 ) 在C O S - 7细胞中的蛋白 表达 2 . 成功地将p c D N A 3 . 1 + l fl k - 1 ( , _-; 转 化了 减毒沙门氏 菌S L 3 2 6 1 ， 制备成以S L 3 2 6 1 为 载体的0 服D N A疫苗p c D N A 3 . 1 + l fl k - 1 (n 1 _7 ) . 3 ， 皮下 动 物模型显 示: 疫苗组小鼠 的中 位生存 期昆明医学院博 】 : 研究生学位论文较空质粒组和生理盐水组分别长2 5 . 2 s 天。

4 . 在对皮下动物模型研究中发现:1 )流式细胞术示:在接种疫苗前、后三组之间C D 3 + 的值均无显著性差异 ( P > 0 . 0 5 ) ;接种肿瘤后空质粒组和生理盐水组较疫苗组明显下降， 有显著性差异 ( P 0 . 0 5 ) -,疫苗接种后C D 8 + 的值在疫苗组明显的增高，与其它两组对比 有显著性差异 (( P 0 .0 5 ) . 3 )透射电镜发现疫苗组肿瘤细胞多数细胞分化较空质粒组和生理盐水组好 5 . 在对肝转移动物模型研究中发现: 1 ) 流式细胞术示: 接种肿瘤细胞前三组的C D 4 4 v 值无显著性差异( P > 0 .0 5 ) ,接种肿瘤细胞后空质粒组和生理盐水组的C D 4 4 v 明显的比疫苗组高， 有显著性差异( P 0 .0 5 ) .结论:1 .成功 地克隆出2 2 8 6 b p 的V E G F R 2 胞外c D N A全 长， 测 序 证实 所获基因 序列与G e n e B a n k 公布的鼠血管内皮生长因子受体2 胞外段序列一致 2 . 成功地构建了重组 质粒p c D N A 3 . 1 + / fl k - ] (, 1 _7 ) ， 且在真核表达 系统中 得到了 表 达。

3 制备 成以S L 3 2 6 1为 载体的口 服D N A疫苗p c D N A 3 . 1 + / f l k - 1 (n , .7 ) 4 . 该 疫苗能 延长结 肠腺 癌皮下 动物模型的中位生存期 5 该疫苗能显著抑制小鼠结肠腺癌的血管生成 6 . 该疫苗能显著减少小鼠结肠腺癌的肝转移灶并抑制其生长 7 . 该口 服D N A疫苗可能具有诱导细胞分化作用 8 .该口服D N A疫苗的作用机制， 可能是通过激活细胞免疫起到抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移作用关键词:V E G F R 2 fl k - 1 口 服 D N A疫苗 大肠癌 抗血管生成 转移昆明医学院博十研究生学位论文A n O r a l D N A V a c c i n e p c D N A 3 . 1 + f fl l i - 1 (a .7 ) a g a i n s tA n g i o g e n e s i s i n C o l o r e c t a l C a n cerABS TRACTO b j e c t i v e T o c o n s t r u c t a n o r a l D N A v a c c i n e p c D N A 3 . 1 + / fl k - 1 ( , _7 ) a g a i n s t t u m o ra n g i o g e n e s i s a n d i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s a n d m e c h a n i s m o f t h e v a c c i n e o n t u m o rd e v e l o p me n t a n d m e t a s t asi s i n v i v o .Me t h o d s 1 .T o t a l R N A w as e x t r a c t e d fr o m B A L B / c而c e e m b r y o . E x t r a c e l l u l a rd o m a i n o f fl k - 1 w a s a m p l i f i e d b y r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e - p o ly m e r as e c h a i n r e a c t i o n( R T P C R ) . A f t e r c o n f i r m e d b y D N A s e q u e n c e a n a l y s i s , f l k - 1 ( l _7 ) c D N A w a s i n s e rt e di n t o e u c a ry o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p c D N A 3 . 1 + c o n t a in i n g C MV p r o m o t e r . T h er e c o m b i n a n t p l as m i d s p c D N A 3 . 1 + / f lk - l (, 1 a ) w a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d i n t oe u c a r y o t i c e x p r e s s i o n s y s t e m C O S - 7 c e l l s b y l i p o f e c t a m i n e . T h e n d e t e c t i n g p r o t e i ne x p r e s s i o n o f fl k - 1 W , .7 ) b y W e s t e rn b l o t . 2 . T h e r e c o m b i n a n t p l as m i d p c D N A 3 . l + /f lk - ] ( , _ 7 ) w a s t r a n s f o r m e d i n t o a t t e n u a t e d S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m S L 3 2 6 1 t od e v e l o p a n o r a l D N A v a c c i n e a g a i n s t t h e e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f fl k - 1 . 3 . M i c e w e r ed i v i d e d i n t o 3 g r o u p s ( D N A v a c c i n e g r o u p , v e c t o r g r o u p a n d s a l i n e g r o u p ) a n d w e r eo r a l l y i m m u n i z e d w i t h S L 3 2 6 1 t r a n s f o r m e d w i t h t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d ,p c D N A 3 _ 1(+ ) ， o r s a l i n e r e s p e c t i v e l y 3 t i m e s a t 2 - w k i n t e r v a l s . T h e n m i c e w a sc h a l l e n g e d b y s u b c u t a n e o u s ( s .c .) i n j e c t i o n o f c o l o n i c a d e n o c a r c i n o ma c e l l s ( C T - 2 6 )i n t o t h e r i g h t a r m p i t 2 w e e k s a f t e r t h e l a s t i n u n u n i 。