食品中大肠菌群的测定附MPN检索表.docx

实验六食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家 1994 年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群 (coliform bacteria)系指一群在37°C、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏 菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4靛基质甲基红V-P拘橼酸HS2明胶动力C糖大肠艾希氏菌I++————+/-+大肠艾希氏菌II+————+/-—大肠艾希氏菌III++————+/-—费劳地拘橼酸杆菌I+++/-+/-费劳地拘橼酸杆菌II++++/-+/-产气克雷伯氏菌I——+—————产气克雷伯氏菌II+++乳表5-4 大肠菌群生化特性分类表阴沟肠杆菌 + — + + — — +/——注：+,表示阳性；一，表示阴性；+/-,表示多数阳性，少数阴性由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和III型的特点是，对靛 基质、甲基红、v-p和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”通常 称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌二)大肠菌群的测定意义1、 粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中 病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常 见细菌。

一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold. Smith)氏指出，大肠杆 菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于 人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污 染的指标菌据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为:108个/g— 109个/g 若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就 有可能有肠道病原菌存在根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的 水或食品供食用是不安全的所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验 时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌当然，有粪便 污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水 或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的2. 粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确 的指标作用① 存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不 再繁殖④检验方法简便，易于检出和计数在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪 便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间 与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便 易行。

因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟 杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据 报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内 细菌组分的50%以上，一般粪便中该菌量为109个/g—10io个/g肠道内 属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、 变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌很多研究者认为， 在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌 容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群 链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜上述 的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指 标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：① 饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖② 在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。

3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中 有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自 然界存在的主要原因在腹泻患者所排粪便中，非典型大肠杆菌常有增多趋 势，这可能与机体肠道发生紊乱，大肠菌群在型别组成的比例上因而发生改 变所致；随粪便排至外环境中的典型大肠杆菌，也可因条件的改变使生化 性状发生变异，因而转变为非典型大肠杆菌由此看来，大肠菌群无论；庄 粪便内还是在外环境中，都是作为一个整体而存在的，它的菌型组成往往是 多种的，只是在比例上，因条件不同而有差异因此，大肠菌群的检出，不 仅反映校样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加 工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验 项目，如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的 可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染 肠道致病菌所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生 学上是不合格的，该食品食用是不安全的。

二、实验目的1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义2、学习并掌握大肠菌群的检验方法三、原理大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴 性无芽孢杆菌该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价 食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义它反映了食品是否被粪便污染， 同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性食品中大肠菌群数系以每100g （或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称 MPN）表示三、材料1 、样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品2、菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）3、培养基及试剂单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美 蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯（MA）4、其它设备和材料温箱（36 土 1）°C、水浴锅（44 土C、天平、显微镜、均质器或乳钵、温 度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针四、实验步骤（一）检验程序大肠菌群检验程序见图 5—2（二）操作步骤1．采样及稀释① 以无菌操作将校样25g（或25mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他 稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分 振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。

固体检样最好用无菌均质器，以 800r / mjn一1000r / min的速度处理lmin，做成1： 10的稀释液② 用1mL灭菌吸管吸取1： 10稀释液ImL,注入含有9mL灭菌生理盐水或 其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成 1：100 的稀释液，换用 1 支 lmL 灭 菌吸管,按上述操作依次作 10 倍递增稀释液③ 根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种 3 管也可直接 用样品接种2．乳糖初发酵试验 即通常所说的假定试验其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体 的细菌将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内,接种量在 1mL 以上者,用双料乳 糖胆盐发酵管 1mL 及 1mL 以下者,用单料乳糖发酵管每一个稀释度接种 3 管，置（36 土 1）°C培养箱内，培养（24 土 2）h,的所有乳糖胆盐发酵管都不 产气,则可报告为大肠菌群阴性,勿有产生者,则按下列程序进行如有产 生者，则按下列程序进行3．分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（36 土 1）C温箱内，培养18h — 24h,,然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验4．乳糖复发酵试验 即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应 的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群 1—2 个进行革兰氏染色， 同时接种乳糖发酵管，置（36 士 l）°C的温箱内培养（24 土 2）h，观察产气情况检样稀释乳糖胆盐发产气大肠杆菌扌报告伊红美蓝琼脂乳糖发酵管革兰氏染革兰氏阳革兰氏阴性无芽 ——不产产气大肠菌群大肠菌群阳大肠菌群报告报告报告凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌 阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性5．报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表(见表 5—4)，报告每100mL(8)食品中大肠菌群的最可能数MPN 检索表阳性管数MPN100mL(g)95%可信限lmL(g) X(g) X3(g) X3下限上限0003000130<59000260003900103001160<51300129001312002060021900221200231600309003113003216003319010040<5200101701021010211010315011070102301111103036011215011319012011030360121150122200123240130160131200132240133290续表阳性管数MPN95%可信限lmL(g) X3(g) X3(g) X3100mL(g)下限上限20090303602011407037020220020326021015030440211200708902。