大蒜中SOD活性的测定.docx

大蒜中SOD活性的测定一、 实验目的：(1) 掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤2) 了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数3) 掌握离心机的使用二、 实验原理：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物，中 间物的积累在滞留30〜45s 后,与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中 间物在420nm波长处有强烈光吸收当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成 O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性三、 实验试剂：大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液(PH7.8, 0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、 天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三 角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、 移液管各5根四、 实验步骤：(1) SOD 提取：称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液， 研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。

留出1mL备用， 准确量取剩余上清液体积，记录)(2) 除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min, 6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液 (取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)(3) SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min, 6000rpm离心15min,得到SOD酶沉 淀将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀6000rpm离心15min,取上清得到 SOD酶液取1mL备用，其余量取体积4) 粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值试剂/ (mL)空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333SOD提取液000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2(5)溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定 吸光值，按公式计算蛋白质浓度提取液稀释：50 x粗酶液稀释：20 x酶液稀释：10 x五、实验数据：提取液粗酶液酶液总体积(ml)提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280— 0.74A260) x稀释倍数蛋白质浓度(mg/ml)对照管(OD1) 提取液(OD2) 粗酶液(OD2) 酶液(OD2)420nm吸光值六、 实验结果及数据处理：(1) 酶活力单位提取液酶活力单位：=2 (OD1-OD2) x5/0.1= 粗酶液活力单位：=2 (OD1-OD2) x5/0.1= 酶液活力单位：=2 (OD1-OD2) x5/0.1=(2) 总活力提取液总活力口=活力单位x总体积=粗酶液总活力=活力单位x总体积=酶液总活力=活力单位x总体积=(3) 比活力提取液酶液比活力口/皿£=活力单位/蛋白质浓度= 粗酶液比活力口/皿£=活力单位/蛋白质浓度= 酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=(4) 纯化倍数粗酶液纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=(5) 回收率粗酶液回收率=粗酶液总活力/提取液总活力= 酶液回收率=酶液总活力/提取液总活力=七、 实验结果误差分析：(1) 研磨和离心大概还不够充分。

2) 由于测量仪器的精密度引起的误差3) 在操作的过程中，加入邻苯三酚后未混合均匀，可能致使化学反应进行得不很充分， 这可能是造成实验数据与预期不符的一个原因；(4) 在实验过程中，所需化学试剂加入的量不是很准确，这可能是实验数据出现问题的另 一个原因；(5) 此外，实验本身还很粗糙，酶的提取、分离和纯化都不能十分彻底，还有很多杂蛋白干扰实验氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴 离子自由基的酶本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定 酶活性大小在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易 再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收而SOD 可清除02,从而抑制了甲腙的形成于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈 低，反之酶活性愈高据此可以计算出酶活性大小。