石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤).docx

石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、 用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、 将器皿在自来水下冲洗干净3、 将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干 注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3 次即可烘干备用，如果做特殊染色还需 浸泡在酸性清洁液内12~24 小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3 次 烘干备用二）配制： 硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ ml）lOOO2OOlOO重铬酸钾（ mg）63l2OlOO蒸馏水 （ ml）2OO2OOlOOO重铬酸钾 1200g蒸馏水 2000ml将 2000ml 浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24 小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3 遍3. 95%~100%酒精浸泡24 小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：O.lmol/L磷酸二氢钠B液：O.lmol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3： 7~PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：O.lmol/L枸椽酸B液：O.lmol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2： 42.8~PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛： 10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml 注：实际甲醛含量只有 3.6~4.0%但习惯上都将其视为 10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和（以容器底部碳酸钙沉淀 1~2cm 厚为适度）充分振荡混合后，放置 24 小时 取上清液使用3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛 8g蒸馏水 100ml加温至60左右，不时搅拌，成为乳白色溶液滴加1N NaOH,并不停搅动至液体清明1N NaOHlN 等于 1L 溶液中某种物质 1mol 除以该物质的氢当量价所得数值的量氧化钠（NaOH ）；分子量=40. 005，当量价=11N Na0H的配制方法为：m=40. 005/ 1=40. 005g取40. 005gNaOH溶解于1L蒸馏水 中4%多聚甲醛8%多聚甲醛 50ml0.1M 磷酸盐缓冲液 50mlPH7.2先取 50 ml 8%多聚甲醛，用 0.1M 磷酸二氢钠和 0.1M 磷酸氢二钠将 PH 值调至 7.24. Bouin 液：苦味酸饱和水溶液 75ml36％~40％福尔马林液 25ml冰醋酸 5m15. 改良 Bouin 氏固定液苦味酸饱和水溶液 45ml95%酒精 45ml36％~40％福尔马林液 5ml冰醋酸 5m16. Carnoy 液：冰醋酸 10 m1氯仿 30 m1 无水乙醇 60 m1以上三者临用前混合，预冷至4°C后使用。

24小时后固定液失效三）染色液1. Harris苏木精液A 液： 苏木精 无水酒精B 液： 铵矾或钾矾蒸馏水氧化汞 冰醋酸 将矾溶于水1g10ml20g200ml0.5ml8ml加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却,加氧化汞，再继续加热 1 分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml 冰醋酸，放置1 周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月此染液在加醋酸后，对核染色 特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但 利于配后即用1g50g0.2g1000ml2. Mayer 苏木精掖 苏木精钾矾或铵矾50g1g钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜碘酸钠 蒸馏水 水合氯醛 枸橼酸将苏木精， 再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5 分钟，冷后过滤备用如不急用可不煮沸而在室温 待其成熟，染液可较长期贮存使用核染色鲜明，染色时间5—10 分钟用该染液染色后， 不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。

3. Hasnsen 甲矾苏木精的配制A 液：苏木精1g无水乙醇10mlB 液：钾矾20g蒸馏水200mlC 液：高锰酸钾1g蒸馏水16ml三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml,充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分 钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为 蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化） 4．伊红0.5~1%水溶液或酒精溶液1．水溶性伊红 伊红 5~10g蒸馏水 1000ml 冰醋酸 10滴 先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸2．醇溶性伊红 伊红 5~10g70%~90%酒精 1000ml冰醋酸 10滴（四）其它1 ．麻醉剂：2~4%戊巴比妥钠， 1ml/kg 体重（ 45mg/kg） 2．各级浓度酒精的配制75%； 85%； 95%； 100%酒精75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水 至95ml，即为75%酒精）3．盐酸洒精 多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色配法是在 100ml 的 70％酒精内加 0.5〜1ml的浓盐酸（Hcl）。

用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再 作其他处理4．碘酒取碘5g,溶于95%酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成5．生理盐水以氯化纳 0.85〜0.90g 溶于 100m1 蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物 石蜡切片制备基本步骤 之二三、取材，固定（一） 实验动物的抓取及固定1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法 要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会 后再抓；（ 4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上2．实验家兔的抓取及固定方法要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法 3．豚鼠的抓取及固定方法 要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到 动物固定台上二） 实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法1．编号和标记方法（1）染色法 标记溶液：3%~5%苦味酸2%硝酸银0.5%中性红或品红 龙胆紫 编号原则：先左后右，从前到后黄色咖啡色（涂后光照10 分钟） 红色紫色左前脚为 1，左侧腹为 2，左后腿为 3，头顶为 4，腰背部为 5，尾基为 6，右前脚为 7，右 侧腹为 8，右后腿为 9。

超过10 可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位 数2）挂牌法（3）耳孔法 一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法2．实验动物的随机分组方法 动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人 为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组3．实验动物被毛去除方法剪毛法拔毛法 剃毛法 脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤 血液循环和病理变化方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮 肤然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层， 经 2~3min 后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮 肤脱毛剂配方：（1）硫化钠 3g肥皂粉 1g淀粉7 g加水适量调成糊状2）硫化钠 8g溶于 100ml 水中（3）硫化钠 8g淀粉7 g糖4 g甘油 5 g硼砂 1 g加水 75ml（三） 实验动物处死处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死 亡状态热爱生命，珍爱动物1．空气栓塞致死法要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50〜100ml注射器一只；（3） 此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。

2．麻醉后处死法 注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈 1 ）吸入麻醉法要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂 棉；（ 3）时间大约 1〜2 分钟；（ 4）注意防火（ 2）注射麻醉法 要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是 腹腔注射；（ 3）注射致死量一般视动物大小而定3．脑、脊破坏法 要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓4．断头处死法要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和 躯干分离5．断椎法要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（ 3）此方法处死动物组织结 构保存较好四） 实验动物解剖解剖步骤1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛； 2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下 端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应 尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。

然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器五） 取材 取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后 变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大 量的酶失活和丢失取材方法和注意事项（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹 过的或用手压过的组织均不可用2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块 法等）（3）取材的先后顺序原则根据死后组织结构改变的速度的快慢而定先腹腔后胸腔，先 消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以 1.0cmxl.0cmx0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定5） 较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其 表面一侧的被膜6） 管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开 管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生 理盐水漂洗黏膜表面，然后固定7） 较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1〜2cm长，平 铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。

8） 取材要尽量注意脏器的完整性9） 应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面对于病理材料，除。