第四讲营养缺陷型菌株筛选课件.ppt

诱变育种诱变育种诱变剂诱变剂诱变育种步骤诱变育种步骤物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂出发菌株的选择出发菌株的选择单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备菌丝尖端法菌丝尖端法处理菌落周围的尖端菌丝处理菌落周围的尖端菌丝混合培养法混合培养法原生质体是异质的原生质体是异质的不具有细胞壁不具有细胞壁不产孢子的菌株诱变时会有遗传不产孢子的菌株诱变时会有遗传分离或遗传不稳现象分离或遗传不稳现象诱变处理诱变处理诱变剂种类选择诱变剂种类选择最适诱变剂剂量的选择最适诱变剂剂量的选择诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式影响突变率的因素影响突变率的因素1、菌种的遗传特性不同、菌种的遗传特性不同2、菌体的细胞壁结构不同、菌体的细胞壁结构不同3、环境条件的影响、环境条件的影响 ①①诱变前预培养和诱变后培养诱变前预培养和诱变后培养 ②②温度、温度、pH、氧气等外界条件、氧气等外界条件 对诱变效应的影响对诱变效应的影响 ③③平皿密度效应平皿密度效应第一页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选第三节营养缺陷第三节营养缺陷(quēxiàn)(quēxiàn)(quēxiàn)(quēxiàn)型菌株的筛型菌株的筛选选 营养缺陷(quēxiàn)(quēxiàn)型在生产上和科学研究上用途很大。

目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型 研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料营营养养(yíngyǎng)缺缺陷陷型型的的用用途途第二页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选一、基本概念一、基本概念二、筛选二、筛选(shāixuǎn)营养缺陷型的步骤营养缺陷型的步骤（一）诱变(yòu biàn)（二）淘汰野生型（三）检出缺陷型（四）确定生长谱第三页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选1 1、野生型菌株（、野生型菌株（wild type strainwild type strain））2 2、营养缺陷型（、营养缺陷型（auxotrophauxotroph）：）： 指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺缺缺乏乏乏乏合合合合成成成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中加入中加入(jiārù)(jiārù)相应的营养成分才能正常生长的变异株相应的营养成分才能正常生长的变异株3 3、原养型（、原养型（prototrophprototroph）：）： 营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株经经回回回回复复复复突突突突变变变变或或重重重重组组组组变变变变异异异异后后产产生生的菌株，其营养要求在表型上相同。

的菌株，其营养要求在表型上相同一、基本概念：一、基本概念：第四页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选与之有关的培养基有三类1 1、基本培养基、基本培养基(MM)(MM)：：minimal mediumminimal medium 能满足野生型菌株正常生长的培养基；能满足野生型菌株正常生长的培养基；[-][-]2 2、完全培养基、完全培养基(CM)(CM)：：complete mediumcomplete medium 能能满满足足各各种种( (ɡ ɡè è zhzhǒ ǒn nɡ ɡ) )营营养养缺缺陷陷型型营营养养要要求求的的天天然然或或半半合合成成培培养养基基，，如如牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基、、麦麦芽芽汁汁培培养基；养基；[+][+]3 3、补充培养基、补充培养基(SM)(SM)：：supplemental mediumsupplemental medium 在基本培养基中加入相应的营养成分；在基本培养基中加入相应的营养成分；[A][B][A][B]第五页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选二、筛选营养二、筛选营养(yíngyǎng)(yíngyǎng)(yíngyǎng)(yíngyǎng)缺陷型的步骤缺陷型的步骤uu诱变(yòu biàn)(yòu biàn)uu淘汰野生型uu检出缺陷型uu确定生长谱第六页，共十五页。

第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选（一）诱变（一）诱变(yòu biàn)(yòu biàn)(yòu biàn)(yòu biàn)方法方法用于诱发营养(yíngy(yíngyǎ ǎng)ng)缺陷型的诱变剂有：uu亚硝基胍uu紫外线uu亚硝酸第七页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选1 1、抗生素法：、抗生素法：、抗生素法：、抗生素法：原理：原理：一般细菌可以采用青霉素，酵母一般细菌可以采用青霉素，酵母(jiàom(jiàomǔ ǔ) )可采用制霉菌素可采用制霉菌素2 2、、、、菌菌菌菌丝丝丝丝过过过过滤滤滤滤法法法法：：：：对对于于霉霉菌菌，，因因孢孢子子生生长长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝丝滤滤去去，，而而缺缺陷陷型型孢孢子子却因未发芽而不能滤过却因未发芽而不能滤过3 3、、、、高高高高温温温温杀杀杀杀菌菌菌菌法法法法：：：：利利用用芽芽孢孢菌菌类类的的芽芽孢孢和和营营养养体体对对热热敏敏感感性的差异性的差异二）淘汰（二）淘汰(táotài)(táotài)(táotài)(táotài)野生型野生型MMCMCMMMMMCM加青霉素第八页，共十五页。

第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选 （三）缺陷三）缺陷(quēxiàn)(quēxiàn)(quēxiàn)(quēxiàn)型的捡出型的捡出uu原原理理：：缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长 uu具体方法：具体方法：影印(y(yǐ ǐngyìn)ngyìn)法、点种法 夹层法 、限量补充法无营养无营养(yíngyǎng)缺陷缺陷MM MM+FCM其他营养其他营养缺陷缺陷F营养缺陷营养缺陷第九页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选（（1 1））将将一一较较平平皿皿直直径径小小1cm1cm的的金金属属圆圆筒筒蒙蒙上上一一层层灭灭菌菌(miè (miè jūn)jūn)的丝绒，用金属夹夹住，灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌(miè jūn)(miè jūn)2 2））完完全全培培养养基基上上长长出出的的全全部部菌菌落落在在丝丝绒绒上上轻轻轻轻一一压压，，使使之成为印模，标记方位之成为印模，标记方位3 3））将将基基本本培培养养基基平平皿皿和和完完全全培培养养基基平平皿皿在在标标记记的的同同同同一方位一方位一方位一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上 １、影印１、影印(yǐngyìn)(yǐngyìn)(yǐngyìn)(yǐngyìn)法法第十页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选（（4 4）将）将CMCM和和MMMM在恒温箱中培养在恒温箱中培养5 5））二二平平皿皿相相同同方方位位进进行行比比较较，，即即可可发发现现在在MMMM平平皿皿上上长长出出的的菌菌落落少少于于CMCM平平板板上上的的MMMM上上未未长长而而相相应应于于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型上长出的那几个菌落就可能是缺陷型 此此法法要要求求平平皿皿上上菌菌落落不不能能太太多多，，菌菌落落之之间间应应有有(yīnɡ yǒu)(yīnɡ yǒu)一定间隔一定间隔MMCM第十一页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选 ２、点种２、点种(diǎn zhǒng)(diǎn zhǒng)(diǎn zhǒng)(diǎn zhǒng)法法uu 用用接接种种针针或或牙牙签签将将CMCM上上长长出出的的菌菌落落(jūnluò)(jūnluò)在在MMMM和和CMCM两两副副平平板板上上接接种种，，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，，然然后后一一起起培培养养，，观察其生长情况。

观察其生长情况uu 此法结果明确，但工作量大此法结果明确，但工作量大CMCMMM第十二页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选 ３、夹层３、夹层(jiācéng)(jiācéng)(jiācéng)(jiācéng)法法 先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，，培培养养24h24h，，将将将将出出出出现现现现的的的的菌菌菌菌落落落落标标标标记记记记，，，，然然后后倒倒上上一一层层CMCM琼琼脂脂培培养养基基，，再再培培养养这这时时第第二二批批长长出出的的菌菌落落就就可能是缺陷型可能是缺陷型 此此法法缺缺点点是是，，结结果果有有时时不不明明确确(míngquè)(míngquè)，，而而且且将将缺缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易陷型菌落从夹层中挑出并不很容易基本琼脂培养基含菌的MMCM第十三页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选该法有两种情况：（1）目的是捡出营养缺陷型　　方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长(shēngzh(shēngzhǎ ǎng)ng)缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。

2）目的是定向筛选某种特定的缺陷型　　在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质 ４、限量４、限量(xiànliàng)(xiànliàng)补充法补充法第十四页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选第四讲营养缺陷型菌株筛选内容(nèiróng)总结诱变育种②温度、pH、氧气等外界条件目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型1、野生型菌株（wild type strain）指通过诱变而产生的缺乏合成某些(mǒu xiē)营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上相同[A][B]具体方法：影印法、点种法夹层法 、限量补充法第十五页，共十五页第四讲营养缺陷型菌株筛选。