蛋白诱导-LJ培训讲学.ppt

实验四基因的诱导表达与融合蛋白的纯化实验目的掌握基因诱导表达的原理与方法掌握蛋白质纯化的基本原理巩固蛋白质电泳的基本方法*3单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式基因工程的下游技术基因的诱导表达和重组蛋白的纯化二、表达瓶颈1、蛋白翻译后折叠、修饰；2、蛋白翻译后易降解、形成包涵体；3、蛋白分离纯化、复性；4、基因表达调控三、表达方式 融合蛋白 1、基因融合：将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，表达产物是一个杂和蛋白，靶蛋白连接在运载蛋白（识别标签）的氨基端或羧基端 2、应用潜力： 简化靶蛋白的标记与分离； 靶蛋白与信号肽连接，将靶蛋白分泌到特定细胞区； 保护靶蛋白免受宿主蛋白酶降解； 改善靶蛋白溶解性，防止形成包含体识别标签 -半乳糖苷酶（lac-Z） 谷胱甘肽-S-转移酶（GST） 多聚组氨酸（poly-his） 人工7肽FLAG人工标签*8单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等如GST融合蛋白用GST柱亲和层析;多聚His标签6His，便于镍柱亲和层析纯化。

分泌信号筛选标记其它纯化条件宽松由于螯合作用不受变性剂等因素的影响，故可在SDS或尿素等存在的条件下进行纯化，这对一些溶解度不佳的重组蛋白的纯化尤其有利四、表达体系选择常用体系大肠杆菌体系（菌株+载体） 依据： 蛋白大小（100 amino acid residue） 蛋白数量 蛋白活性要求（产生抗体、生物学研究、 结构研究）主要表达小的细胞因子和生长因子*10单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式 五、实验流程： 细菌 亲和层析IPTG诱导细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析六、实验原理 重组蛋白的表达方式与纯化方式是由表达载体决定的 在原核表达系统，表达载体均携带一个条件表达的启动子，由这一启动子控制外源基因的表达 在未经诱导的情况下，外源基因不表达，这就防止了外源基因产物对细菌正常生长的干扰在细菌生长达到一定数量时再加入诱导剂诱导基因表达，可最大限度提高重组蛋白的产量 重组蛋白的表达与诱导剂加入的时间和浓度相关七、本实验表达载体pGEX系统含有启动子(tac)及Lac操纵基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等调控序列SD序列下游就是GST基因，使克隆的外源基因与GST基因相连。

表达产物为谷胱苷肽-S-转移酶和外源蛋白的融合体优点：可诱导高效表达；表达的融合蛋白质纯化方便；使用凝血酶和Xa因子就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽表达产物: GST-目的蛋白The structure of lac operon调节序列结构基因I阻遏因子Repressor and negative regulation异半乳糖异丙基硫代半乳糖苷异半乳糖 本实验采用的pGEX 4T-1表达载体，外源基因与GST形成GST-融合蛋白由于GST能特异性结合谷胱甘肽，因此在纯化时可利用偶联谷胱甘肽的琼脂糖凝胶进行亲和层析，纯化过程简便且产物纯度高八、影响外源蛋白表达的主要因素细胞生长速率细胞生长温度（20-37 ）诱导剂浓度和诱导时间首先进行小规模预实验确定最佳条件大规模培养进行提取、纯化目的蛋白九、操作步骤（一）融合蛋白的诱导表达 1接种2个单菌落（转化了空质粒pGEX-4T-1的BL21菌种及携带112的菌种）于5ml LB Amp+液体培养基，37振荡培养过夜 2将500l过夜培养物与50ml Amp+LB混合，37振荡培养4小时放大培养 3将培养物分成8管，每管5ml，按下表所示加入IPTG，30 振荡培养4小时。

序号加入的100mM IPTG的体积积（ ul ）IPTG终浓终浓度（mM）诱导时间诱导时间 （小时时）1（空质质粒）-42（112）-43（空质质粒）250.544（112）50.145（112）250.546（112）501.047（112）1002.048（112）2505.04 4. 每管菌液3000rpm离心5分钟，收集沉淀，弃上清 5. 每管各加入200 l 的上样缓冲液，振荡煮沸变性5分钟备用 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE) 优点： (1)凝胶透明，有弹性，机械性能好 (2)化学性能稳定 (3)对pH和温度变化较稳定 (4)几乎无电渗作用，样品分离重复性好 (5)样品不易扩散，灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。

(7)分辨率高 PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分子质量、等电点等 PAGE原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷 效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好 1.浓缩效应 (1)凝胶孔径的不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性2.分子筛效应3.电荷效应SDS-PAGE原理SDS即十二烷基硫酸钠，是阴离子去污剂，和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物；SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1安装电泳装置 2配制12% 分离胶10ml： 4 0% Acr/Bis 3.0 ml 1.5 mol/L Tris pH 8.8 2.5 ml H2O 4.3 ml 10% SDS 0.1 ml 10% 过硫酸铵 0.1 ml TEMED 0.004 ml 小心滴加ddH2O覆盖于分离胶表面，静置 30min待凝胶凝结，弃去上层水。

3配制5%浓缩胶5ml： 30%Acr/Bis 0.625 ml 1 mol/L Tris pH 6.8 0.63 ml H2O 3.6 ml 10% SDS 0.05 ml 10% 过硫酸铵 0.05 ml TEMED 0.005 ml 4电泳 (1)上样 20 ul (2)电泳 浓缩胶段：80 V/cm 分离胶段：120 V/cm 5考马斯亮蓝染色：将电泳胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，室温放置10分钟 6脱色：将电泳胶从染色液中取出，浸泡于脱色液中，每隔20分钟换一次脱色液三次后，脱色过夜7.结果观察8.选择最佳生长温度、诱导浓度、诱导时间； 进行500ml大规模培养裂解细胞纯化融合蛋白应用。