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溶酶体分离与鉴定关键词：细胞 蔗糖溶液 磷酸酶 磷酸 溶酶体 试剂 标准物质1・溶酶体的分离 溶酶体为细胞质内由单层脂蛋白膜包绕的内含一系列酸 性水解酶的小体，是细胞内具有单层膜囊状结构的细胞器溶酶体内含有许多种 水解酶类,其中多数适合在酸性条件下发挥作用容酶体直径约0. 025〜0. 2gm, 所以需要更大的转速才能获得把分离线粒体时的上清液以16 300g离心20分 钟，弃上清，沉淀加入10ml预冷的0. 25mol / L,蔗糖溶液悬浮，用同样的条 件再离心1次2 溶酶体的鉴定(1) 光镜直接观察：溶酶体的外形在光镜下不能看见，但可以看到棕黑色的 颗粒和斑块溶酶体可用酸性磷酸酶(ACP)显示法进行鉴定ACP广泛存在于动 物组织，主要定位于溶酶体内在溶酶体膜稳定完整时，底物不容易渗入，ACP 活力微弱或无活性，经固定后，在合适pH条件下，膜本身变得不稳定，底物可 以渗入，酶活力被显示此酶在pH 5. 0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出 磷酸基，与底物形成沉淀2) 电镜观察：溶酶体常指初级溶酶体或者前体溶酶体，电子密度相对较高， 由大量细小的微粒填充，通常呈球形，直径约为25〜200nm。

电镜技术在溶酶体 的形态学和功能学研究中发挥了重要的作用3) 细胞学检测：LAMP1和LAMP2组成了 50%的溶酶体膜蛋白，常规采用细 胞免疫荧光的方法用抗体去结合LAMP1或者LAMP2蛋白，从而识别溶酶体LAMP 又名溶酶体相关膜蛋白，分为1型和2型，因为是溶酶体膜上特有的唾液酸糖蛋 白，所以采用LAMP抗体标记溶酶体的方法特异性很强(图5-3-7)細胞絆皿定.戲很.封供后，采円I AMP1拉体索洱螂脊1小时'理輕缘色荧光二抗标记I小討•我中■緑龟即为第前絃，蓝色为DAP!染色的细胞核此外，溶酶体染色还经常选择探针类染料，Lysotracker探针和Lysosensor 探针Lysotracker可以在活细胞里选择性地标记和追踪酸性细胞器，可自由进 出细胞膜，标记溶酶体方便、高效、快捷、特异，作用机制可能是结合溶酶体膜 并潴留在溶酶体内，缺点在于高浓度标记时特异性明显降低，且长期潴留细胞器 会引起溶酶体内pH上升（图5-3-8）Lysosensor探针则是细胞内的pH荧光指示 剂，溶酶体内特异性的酸性环境可加强该探针的荧光强度，从而在荧光显微镜下 可以判断荧光蓄积处茸为溶酶体所在。

由于其荧光强度直接反映出溶酶体的pH 变化，所以Lysosensor探针可以胃采醑究溶酶体的功能学，其缺点同样是长期 潴留会导致溶酶体pH环境变化蚩£-3卫 竖LyseT^ckar^. Rg冥色底的肺动臊向蛊逛临 细85先后经溶酶悴的LysoTrttfker® Red集赳，线数痒 旳 dihydri.irhi>Liaminc 123 藥「• 口览迹胞找的 Hofchsi 染 色'红色硕粒聚集处胆海浴酶体此外，标记溶酶体还可米用cell light由BacMam病毒携带并表达该方法 将GFP或者RFP荧光蛋白连接到目标LAMP1序列上，一旦由病毒转染入细胞表达 后，GFP或者RFP即可特异性地表达于溶酶体膜上缺点在于LAMP1-GFP / RFP 蛋白的过表达会引起内吞胞器的异常聚集由于溶酶体的标记特异性，上述LAMP标记的细胞免疫标记方法，以及探针 标记方法等均可行共聚焦扫描成像，获得细胞器显色清晰且背景干净的优质图 像。