实验3抑菌实验--学生.doc

实验3大蒜浸提液的抑菌实验一、 实验冃的1. 学习抑菌实验的具休方法重点：1、 最小抑菌浓度、最小杀菌浓度的概念怎么测定（试管法、微量法）最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明 显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）:杀死99.9% （降低级3个数最）的供试微牛物所需的 最低药物浓度有些药物的MBC与其MIC非常接近，如氨基糖廿类有些药物的MBC比MIC人，如B内酰胺 类MIC测定方法：常量肉汤稀释法；微量肉汤稀释法；琼脂稀释法MBC值的测定：在培养皿（90nmi）中，倒入已融化并冷却至45°C〜50°C左右的固体培养基，待凝固后，収 MIC中无细菌生长的两孔各lOOpl,分别进行涂布计数，涂布完成后先将培养血在37°C恒温箱中正放1小时，再 翻转培养24〜48h,观察结果以菌落数不超过5个的平板所对应的孔的最低药物浓度即为该药物的最低杀菌 浓度（MBC）2、 倍比稀释的概念。

二倍稀释法，即1体积待测样品中加入1体积去离了水或蒸憎水可以使样品的浓度减少一半这种方法3、 操作注意事项无菌操作，不能移动，瓶塞不要放桌面上（棉花），纸片间保持距离，纸片要贴紧4、 菌种的活化和保存活化：平板（纯化）和斜面一般保藏的方法有：斜面法4°C （霉菌，放线菌保存3・5个月移种一•次，普通细菌1个月），冷冻真空T燥法， 液氮法，甘油保存，液休石蜡法（无菌石蜡加在卜-面lcm,室温或冰箱保存），砂土管法，5、 平板法测抑菌直径：纸片法、牛津杯、打孔法抑菌效果的初步判断）6・灭菌的几种方式（干热火菌160-170°C, l-2h电热干燥箱，高压蒸汽火菌0.1MPa,121°C,小瓶20min,人瓶30min,紫外火菌200-300nm 都有杀菌效果，265-266nm最强，灼烧，过滤除菌0.22pm病毒更小，0.45pm；有机系微孔滤膜、水系微孔滤膜 水系微孔滤膜：适用水溶液，水系，不耐有机溶剂女II：混合纤维素酯膜，又称混纤膜（WX）膜有机系微孔滤膜：疏水，适用有机溶液等女（1：偏氟膜，由聚偏氟乙烯树脂制成，为疏水性滤膜，适用于有机溶 剂及空气过滤而尼龙膜是通用型，满足纯水样品和水/有机混合样品。

二、 实验材料大蒜供试菌种：人肠杆菌、藤黄八叠球菌三、 试剂蛋白丿冻、氯化钠、牛肉膏、琼脂、1 molf'氢氧化钠、生理盐水（0.9%）、75%酒精四、 仪器及用具电子精密天平、电炉、立式压力蒸汽灭菌器、洁净工作台、培养箱、离心机、打孔器、游标卡尺、pH试纸（5.5-9.0）、 烧杯、玻璃林、胶头滴管、量筒、具塞锥形瓶、封瓶膜、林线、接种环、银子、具塞试管、移液管、培养皿、离 心管、滤纸片、枪头、牛津杯、移液枪五、 实验步骤5」玻璃器皿等的包扎以及灭菌具塞试管、移液管、培养皿、离心管、滤纸片、枪头、牛津杯、滤纸5.2培养基的配制以及灭菌【称量及溶化】分别称取蛋白月东l・0g和氯化钠0.5g,置于250mL烧杯中，加入60 mL左右的蒸锚水，用玻璃棒 挑取牛肉膏置于25mL或50mL小烧杯中（或称量纸上），称量0.5g,然后加入少量蒸憎水于该小烧杯中，加热 融化，倒入（洗入）上述250mL烧杯中将此烧杯置于石棉网上加热，用玻璃棒搅拌，使药胡全部溶化调pH】待溶液冷至室温时,用1 mol-L^NaOH溶液调pH至727.4定容】将溶液倒入量筒中，补充水量至lOOmLo【加琼脂】加L5g琼脂，加热融化，补充失水。

分装】分装入2个250mL具塞锥形瓶（一瓶60mL左右大肠，另一瓶40mL藤黄）,分别塞好塞子高压蒸汽灭菌】lOOMPa灭菌20min□即（12TC, 20 min）o5.3菌种活化将试验菌（藤黄八叠球菌、大肠杆菌）从4°C冰箱中取出，分别接种到新鲜斜面培养基中（装有pH7.4的牛 肉膏蛋白J］东固体培养基的试管），各2支37°C恒温培养16・18 h,备用细菌经37°C/24h,酵母菌、硯菌经 28°C/24h恒温培养活化）已活化好5.4菌悬液的制备简单染色并镜检来确定菌种有无变界；如无变界，用无菌生理盐水制备菌原液大肠杆菌的菌落一般是杆状，白色，圆形，透明或半透明，鉴定：大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）革 兰氏阴性短杆菌，大小0.5X1〜3微米周身鞭毛，能运动，无芽胞革兰氏染色阴性菌呈红色藤黄八叠球菌一般八个菌体聚在一起，似“叠罗汉”，亦称为藤黄八叠球菌，也可单个、成双、四联排列或 呈立体包裹状不规则菌落直径一般为1・0〜1・5微米，呈金黄色在所有培养基上均呈堆团排列革兰氏染色阳 性性菌呈紫色菌悬液】在无菌环境下，移取2mL已灭菌的生理盐水于灭过菌的具塞试管中。

川灭过菌的直径为2mm的接种 坏，挑取已活化的藤黄八叠球菌、人肠杆菌原菌液1环分别种在牛理盐水中混匀，备用5.5混合菌悬液与培养基将已灭菌的培养基取出，等培养基内温度降至40C左右还没凝固不烫手时，将菌悬液倒入培养基中，混匀, 备用5.6倒平板将混有菌悬液的培养基，倒入已灭完菌的直径为9.0cm的培养1111中，每皿约20 mL培养基然后将培养皿放 入已预先灭菌20 min的超净工作台中，冷凝，待用若放入4°C冰箱注意倒置5.7样品供试液的制备新鲜大蒜洗尽、晾干，取50g在无菌研磨皿中捣碎、研磨成浆后置于离心机中（4000r/min） 15min,取上清 液为大蒜原汁备用取1.5ml灭过菌的离心管，分别按比例用无菌蒸帑水将大蒜原液配成样品供试液（倍比稀释）: 原液（1200ul原液）、2倍稀释液（600ul原液+600U1灭菌水）、4倍稀释液（2倍稀释液600ul+600ul灭菌水）、 8倍稀禅液（4倍稀释液600ul+600ul灭菌水）置阴凉处备用5.8滤纸片的宜备用打孔器将吸水性强的滤纸制成直径为6mm的圆片，放入干净洁净的培养皿内，高压蒸汽灭菌，lOOMPa灭 菌20mim 干燥、冷却。

5.9不同浓度大蒜浸提液抑菌效果的测定（纸片法）藤黄八叠球菌抑菌实验：以无菌蒸憎水为对照，设置原液、8稀释液共2个浓度梯度分别在培养某表面垂直放上3个牛津杯，在杯 中用移液枪分别加入200PL ffl应浓度的大蒜浸提液每个组2个人用牛津杯）大肠和藤黄各一人，3个人滤纸 片的大肠2人藤黄一人大肠杆菌抑菌实验：以无菌蒸係水为对照，収直径为6nm的己经灭菌的滤纸片，分别放入原液、4倍稀释液的大蒜浸提液中浸泡 时间？，每种浓度2片（滤纸片间的间隔大于30mm）用无菌蹑了将浸泡过的滤纸片稍微沥干后贴在相应的含 菌平板上然后置于37°C恒温培养箱中培养24小时，后取出分别测定抑菌圈直径的大小注：因滤纸片直径为6mm,所以在抑菌圈直径为6mm时抑菌作用实际上为0六、 注意事项6.1蛋白腺很容易吸湿，在称取时动作要迅速6.2称药品时严防药品混杂，一把药匙只能用于一种药品6・3pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度七、 结果与分析八、讨论九、结论。