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河北大学 硕士学位论文 乙酸钠对内毒素休克的保护作用及抗炎机制的研究 姓名：李静 申请学位级别：硕士 专业：药物分析学 指导教师：刘玉欣 2011-06 摘 要 I 摘 要 败血症是临床上常见的危重病症，死亡率高达 50 %以上本论文从体内和体外两 方面实验，研究了乙酸钠（NaA）对 LPS 所致内毒素休克的保护作用及其抗炎机制， 为深入了解短链脂肪酸中最主要成分乙酸对人体有益作用提供了理论依据， 为开发乙酸 饮品及乙酸盐保健食品提供了实验数据 体内实验采用不同剂量的 NaAc 对受试动物预处理 30 min，然后腹腔注射 D-氨基 半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）诱导小鼠急性肝衰竭，观察各组实验动物死亡率，肝脏 组织结构的变化，测定血清 ALT 活性、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及一氧化氮（NO） 的含量体外实验采用不同剂量的 NaAc 对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）预处理 30 min， 然后加入 LPS 诱导炎症因子的产生，通过四甲基偶氮唑蓝微量酶比色法（MTT 法）观 察不同浓度的NaAc对RAW264.7生长活性的影响， 测定细胞培养上清液中NO的含量， 用酶联免疫吸附法（ELISA）检查 iNOS 的含量，采用免疫细胞化学染色及 Western Blotting 方法观察 NaAc 对 LPS 活化 RAW264.7 细胞 NF-κB 的影响。

本实验研究结果表明 NaAc 对实验性急性肝衰竭具有保护作用，显著降低了肝细 胞的损伤（ALT 显著降低） ，以及实验动物小鼠的死亡率，且上述保护作用是由抑制促 炎因子如 TNF-α 和 NO 的产生介导的，其机制之一是 NaAc 抑制了核转录因子 NF-κB 的活性，即通过抑制细胞质内 NF-κB 复合体中 p65 蛋白核转位，从而调节细胞因子、 iNOS 等基因的表达，降低 TNF-α 和 NO 的合成 关键词 乙酸钠 内毒素 脂多糖 一氧化氮 核转录因子-κB Abstract II Abstract Sepsis is a common clinical illness, more than 50 % mortality rate. We searched both from in vivo and in vitro experiments, to study protective effect of sodium acetate against endotoxic shock sodium acetate by LPS and its anti-inflammatory mechanism, in order to provide a theoretical basis for better understanding acetate which is the most important short-chain fatty acids of the beneficial effect for human, and to provide experimental evidence for development of acetic acid and acetic acid salt health food drinks. In vivo by administering different dose of NaAc respectively, after 30 min were injected D-GalN/LPS to induce acute hepatic failure. The mortality and liver injury were observed, and the serum ALT, the tumor necrosis factor α and nitrite oxide (NO) were detected. In vitro the RAW264.7 macrophage cells were pretreated 30 min with different doses of NaAc, then LPS-induced the production of inflammatory cytokines. The effects of different doses of NaAc on proliferation of RAW264.7 macrophages were measured by MTT assay and the optimal dose was chosen. The production of NO was detected. The secretion of iNOS in the supernatant was determined by ELISA. The effects of NaAc on nuclear factor-κB (NF-κB) activation in RAW264.7 macrophages with LPS induction were measured by immunocytochemical method and Western Blotting respectively. The results suggested that NaAc pre-administration reduced liver injury and the mortality, diminished the production of ALT and NO, and the protective effect was inhibition of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and NO production. One of the mechanisms was that NaAc inhibits the activation of NF-κB in RAW264.7 macrophages inducedby LPS, and inhibited the translocation of NF-κB/p65 from cytoplasm to nuclear, which may be the possible mechanism responsible for the inhibition of NaAc on the expression of iNOS and the production of TNF-α and NO. Keywords Sodium acetate Endotoxic shock Lipopolysaccharide Nitric oxide Nuclear factor-kappaB 第 1 章 绪论 1 第 1 章 绪论 1.1 内毒素引起机体免疫应答的作用机制 1.1.1 内毒素概述 天然免疫是机体防御微生物病原体的第一线[1]，它的作用是识别病原体、快速做出 防御应答、激活获得性免疫应答[2]。

许多细菌成分能够激活天然免疫，其中包括细菌脂 多糖（LPS） 、肤聚糖、磷脂酸、脂肽和细菌DNA，而内毒素是能够激活天然免疫的主 要成分LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁内毒素的主要成分，由多糖O抗原、核心多糖和 类脂A（lipidA）组成，类脂A是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分，也是革兰氏细菌激 发宿主免疫应答、导致机体损伤的重要因素[3-5]，各种属细菌类脂A的结构相似有研究 表明，内毒素其生物学活性是与靶细胞相互作用，而并不是直接产生作用，通过细胞信 号转导途径产生，诱导或释放内源性介质实现其生物学效应研究证明内毒素的信号转 导通路与细胞中Toll样受体 4（TLR4） 、脂多糖结合蛋白（LBP） 、和CD14 等多种受体相 关 内毒素通过信号转导通路诱导细胞释放多种炎症介质， 如： 肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 、 白细胞介素-1（IL-1） 、IL-6、一氧化氮（NO）等，这些介质的释放在临床危症如：弥 散性血管内凝血（DIC） 、内毒素血症、内毒素性休克中起着重要的作用[6] 有研究表明，LPS及其它微生物产物被机体先天免疫系统通过Toll样受体（TLRs） 识别，活化下游信号转导途径，从而产生一系列的免疫应答及免疫反应[7-8]；TLRs属于 一类病原分子识别受体，分为胞外和胞内两个区：胞外区含有亮氨酸的重复序列，胞内 区与IL-1 受体的胞内区相似[8-10]。

TLR4 是一个TLRs相关蛋白[l1-l2]，表达于多个免疫和 非免疫细胞的表面，是LPS诱导的免疫反应的识别受体；LPS与TLR4 结合后可以活化下 游信号的转导途径，释放出大量的炎症因子，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等；LPS-TLR4 与全身性感染（因炎症介质过量产生、炎症反应失衡所致）的发生发展有关[13-15]TLR4 是内毒素信号转导通路上游的重要分子，因此TLR4 是理想的药物治疗靶点[16-17]机体 内识别LPS的复合体主要包括TLR4、LBP、CDl4 和MD-2[18-19] 1.1.2 LPS结合蛋白（LBP）和CD14 LPS结合蛋白（LBP）是一种血浆蛋白，由肝脏合成、分泌，其对LPS中的类脂A具 有高度亲和性[20]，可作为LPS载体，使寡聚状态的LPS解离为单体，催化LPS与CD14 和 河北大学理学硕士学位论文 2 TLR4 结合；CD14 作为LPS受体，识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，并将其转运至 LPS-TLR4 受体复合体[3, 21]，介导LPS所致的细胞反应，在LPS炎症反应、内毒素休克 等病理反应中起重要的作用若特异性的阻断CD14 与LPS及LPS/LBP复合物结合， 就能够防止或中止LPS炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒 素血症、内毒素休克等有重要意义。

1.1.3 MD-2 髓样分化蛋白-2（MD-2）是一种无跨膜区的分泌型糖蛋白，通过与TLR4 形成复 合物参与LPS诱导的细胞信号通路MD-2 与TLR4 细胞外区结合，形成TLR4/MD-2 复 合体，TLR4/MD-2 复合体中的MD-2 结合LPS后，引起TLR4 低聚化，进而激发下游信 号MD-2 合成；此外，MD-2 可帮助TLR4 识别LPS-LBP-CD14 复合物，使LPS与结合位 点结合，促进TLR4 介导的LPS信号转导通路[15-16]；MD-2 大部分在内质网/高尔基体和 TLR4 结合，然后以TLR4/MD-2 复合物的形式在细胞表面表达，既能调节TLR4 的胞内 分布，又能辅助TLR4 识别LPSMD-2 具有LPS连接蛋白和肽类的特征，研究发现MD-2 通过 95 位和 105 位半胱氨酸的两个独立功能区将TLR4 介导到细胞膜上， 如果这两个功 能区的任何一个被破坏都会减弱LPS介导的炎症反应[22]因此，MD-2 在TLR4 介导的内 毒素识别和信号转导过程中发挥了着重要的调控作用 1.1.4 TLR4 信号转导通路 在 TLR4 信号转导中有许多转接蛋白的参与，包括转接分子髓样分化因子 88 （MyD88） 、MyD88 转接蛋白样蛋白类似物（Mal） 、IL-1 受体相关激酶（IRAKs）等。

MyD88 作为作为转接蛋白连接 TLR4 和其下游含有 DD 结构域的信号分子， 在 TLR4 信 号转导通路中的起着重要的作用基因敲除技术的研究表明：MyD88 缺陷小鼠并未完 全丧失对 LPS 的反应性， 因此， TLR4 介导的对 LPS 反应存在包括两条信号通路： MyD88 依赖性反应通路和 MyD88 非依赖性反应通路 1.1.4.1 MyD88 依赖性信号转导通路 MyD88 是由羧基端TIR结构域、氨基端死亡结构域（DD）和一个短的连接序列组 成，MyD88 通过TIR结构域与I型IL-。