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荧光定量PCR原理及实验步骤.doc

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卖家[上传人]：飞***

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荧光定量 PCR 原理及实验步骤一、实时荧光定量 PCR 原理常规 PCR 技术对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量 PCR 技术，在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3） Ct 值：（4）标准曲线SYBR Green 工作原理：1、SYBR Green 能结合到双链 DNA 的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光3、变性时， DNA 双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链 DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号二、实验步骤1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量 PCR 仪1、将所需引物和 SYBgreen（避光）拿出，解冻计算好所有引物和 SYBgreen的用量2、反应体系（25μL）如下：H2O 11μLSYBgreen 12.5Μl上游引物 0.25μL下游引物 0.25μLcDNA 1μL可先将 H2O 和 SYBgreen 按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。

4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。

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