中性粒细胞胞外诱捕网放大脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应.docx

中性粒细胞胞外诱捕网放大脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反赵宁;李勇;邵强;杨云;陈家泉;彭巍;胡世林;钱克俭;刘芬【摘要】Objective To observe the amplification effect of neutrophil extracellular traps (NETs) on inflammatory response ofalveolar macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods Neutrophils were isolated and extracted from peripheral bloodof C57 BL/6 mice by using a mouse peripheral blood neutrophil separation kit. NETs were induced by PMA (100 nmol/L). Observa-tion of NETs by fluorescence microscopy and scanning electron microscopy. NR8383 rat alveolar macrophages were cultured invitro and divided into (⑴control group:adding equal volume PBS;⑵NETs group:adding prepared (1.7x106 cell/ml) NETs :⑶ LPSgroup: adding 1 mg/L LPS;⑷ LPS+NETs group:LPS combined with NETs co-stimulation. All groups were stimulated for 12 hours.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of interleukin-10 (IL-1® and tumor necrosis fac-tor-a (TNF-a) in the supernatant of cells. Results Fluorescence microscopy showed that the nucleus of neutrophils in the controlgroup was complete, and there was no extracellular co-localized reticular structure between DNA and NETs. DNA reticular struc-ture could be seen in PMA stimulation group and colocalized with NETs. Scanning electron microscopy also showed that thechromatin of neutrophils was released into extracellular structure, suggesting that the formation of NETs was successfully inducedby PMA.LPS and NETs were used to stimulate alveolar macrophages for 12 hours respectively, the contents of IL-邛 and TNF-ain supernatant of alveolar macrophages were significantly higher than those in control group.The contents of IL-10 in supernatantof LPS+NETs group were significantly higher than those of LPS group (P v 0.05). There was no significant difference in TNF-a insupernatant between LPS +NETs group and LPS group (P > 0.05). Conclusion NETs can amplify LPS-induced inflammation inalveolar macrophages. NETs increased LPS-induced alveolar macrophage inflammatory factor release, suggesting that NETs canamplify LPS-induced alveolar macrophage inflammatory response.%目的观察中性粒细胞胞外诱捕 网(NETs)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的放大作用•方法采用小 鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒分离提取C57BL/6小鼠外周血中性粒细胞.采用佛 波酯(PMA) (100nmol/L)诱导中性粒细胞形成NETs,采用荧光显微镜及扫描电子 显微镜观察NETs.体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,分为⑴对照组:加入等体积 PBS:⑵NETs组:加入制备好的(1.7x106 个/ml) NETs;⑶LPS组:加入1mg/L LPS:⑷LPS+NETs组:LPS联合NETs共刺激，各组均刺激12h.采用酶联免疫吸附试 验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-邛(IL-邛)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a) 含量.结果荧光显微镜下观察示对照组中性粒细胞核形态完整，无DNA与NETs的 胞外共定位网状结构,PMA刺激组可见DNA网状结构,且与NETs共定位;扫描电 子显微镜下也观察到中性粒细胞染色质呈网状结构释放至胞外,提示PMA诱导 NETs形成成功•采用LPS、NETs分别刺激肺泡巨噬细胞12h,细胞上清液中的IL- 邛、TNF-a含量均较对照组显著升高,LPS+NETs组上清液中的IL-邛含量较LPS 组显著升高(P v 0.05),上清液中的TNF-a较LPS组相比差异无统计学意义(P >1—s^offi^ooos offi 【e»星】 愉祓⑥庶遐抵BKffi谛略胀變Iww豐RnffiR紳{h能【»e】【KB^】(9rmCNd)K寸 Dassw】■coo (寸 SO)6IOZ【B・i)Jfr】《霸£[貝》屋加1Sdl-K slLUN 1 f sd」s slLUN 仝吗.(so.of suessisissto SI SHEisffl w®

Gregoire等［6］ 发现ARDS患者与正常人相比，肺泡灌洗液中含有更多的NETS，并会对支气管上 皮细胞造成损伤，对ARDS的进展及预后造成不良影响众所周知，肺泡巨噬细胞在维持肺部内环境稳定和抵抗病原微生物侵袭中发挥关键 作用［7］当外来微生物入侵时，肺泡巨噬细胞被过度激活而失控性释放炎症因子， 是脓毒症肺损伤的根本原因［8，9］ 已有研究表明［10-14］，在创伤、失血性休克 以及脓毒血症等病理条件下，中性粒细胞和巨噬细胞之间的交互作用是调控炎症反应的一个重要因素，如Warnatsch等［15］证实人血中性粒细胞来源的NETs能够 诱导单核巨噬细胞产生更多的细胞因子，从而促进炎症以及动脉粥样硬化的进展 然而，NETs能否放大肺泡巨噬细胞炎症反应，加重脓毒症肺损伤未见报道本研究采用佛波酯（PMA）诱导小鼠外周血中性粒细胞形成NETs，将NETs加入脂 多糖（LPS ）预刺激的肺泡巨噬细胞中，观察细胞上清液中白细胞介素-邛（IL- 邛）、肿瘤坏死因子-a（ TNF-a ）的变化，探讨NETs对肺泡巨噬细胞炎症反应 的放大作用，为治疗脓毒症肺损伤提供新思路1 材料与方法1.1实验材料C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号 SCXK （湘）2016-0002）。

大鼠肺泡巨噬细胞 NR8383 购自中国科学院细胞库； 小鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒购自中国索莱宝公司胎牛血清购自美国Gibc o公司Ham's F-12K培养基购自美国Sigma公司RPMI1640培养基购 自以色列 BI 公司PMA 购自美国 Sigma 公司Anti-Histone H3（citrulline R2+R8+R17）抗体购自英国abeam公司Alexa Flour 594抗山羊荧光抗体购自 中国Bioss公司，DAPI染料购自中国Bioss公司Triton X-100购自中国索莱宝 公司即用型正常山羊血清购自中国博士得生物公司大鼠IL-邛、TNF-a酶联免 疫吸附试验(ELISA )试剂盒购自上海依科赛科技实业有限公司1.2 小鼠外周血中的中性粒细胞的分离提取采用小鼠外周血中性粒细胞分离试剂 盒分离提取C57BL/6小鼠外周血中性粒细胞，按说明书步骤进行操作1.3 NETS的诱导使用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬中性粒细胞接种 5x105个细胞于置有14mm圆形细胞爬片的24孔板，每孔500pl分别加入 PMA ( 100nmol/L )及等体积的培养基孵育3h，细胞爬片用于免疫荧光染色及扫 描电子显微镜观察。

1.4免疫荧光染色采用4%多聚甲醛固定细胞爬片15min , PBS洗3遍后采用 0.5%Triton X-100通透5min , PBS洗3遍，用5%山羊血清封闭，37°C孵育1h 加入山羊抗小鼠Anti-Histone H3多克隆抗体,4C孵育过夜PBS洗3遍后，加 Alexa Flour 594抗山羊荧光抗体，常温孵育1h , PBS洗3遍后，DAPI复染 10min , PBS洗3遍，防淬灭剂封片，荧光显微镜观察图像1.5扫描电子显微镜采用4%戊二醛固定细胞爬片，采用PBS清洗3遍，酒精梯 度脱水，然后将细胞爬片浸入100%六甲基二硅氮中3min，并在无湿气的环境中 干燥，最后采用真空离子溅射仪给样品镀金膜，扫描电子显微镜观察图像1.6 LPS、NETS刺激肺泡巨噬细胞体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，使用含 15%胎牛血清的Ham's F-12K培养基，置于37C, 5%CO2的培养箱中培养 使用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬中性粒细胞,1.7x106个接种于6 孔版，总体积1ml，加入PMA ( 100nmol/L )刺激3h诱导形成NETs采用新 鲜RPMI1640离心洗2遍，最后加入1ml培养基重悬，制备用于后续刺激的 NETs。

将肺泡巨噬细胞NR8383分为4组：⑴对照组：NR8383。