干细胞对肝衰竭的治疗.pdf

干细胞对肝衰竭的治疗干细胞对肝衰竭的治疗中山大学附属第三医院感染科中山大学附属第三医院感染科中山大学附属第三医院感染科中山大学附属第三医院感染科高志良高志良高志良高志良 教授教授教授教授 PH.D M.DPH.D M.D研 究 背 景研 究 背 景肝衰竭肝衰竭肝衰竭肝衰竭: : 各种病因各种病因各种病因所致各种病因所致肝脏解毒、生物肝脏解毒、生物肝脏解毒、生物肝脏解毒、生物合成及生物转换等功能合成及生物转换等功能合成及生物转换等功能的衰竭合成及生物转换等功能的衰竭- 欧美：以药物欧美：以药物(乙酰氨基酚乙酰氨基酚)为主为主- 我国：以病毒我国：以病毒(主要是主要是HBV)为主为主研 究 背 景研 究 背 景ALF病因组成病因组成(USA)37%14%12%18%19%Gill RQ, et al. J Clin Gastroenterol, 2001, 33: 191.病毒病毒特应性药物反应特应性药物反应乙酰氨基酚乙酰氨基酚其他其他未定未定研 究 背 景研 究 背 景肝衰竭目前治疗：肝衰竭目前治疗：?内科综合治疗-----疗效欠佳；?人工肝支持系统-----肝细胞来源不足、免疫 排斥反应;?肝移植治疗-----供肝来源匮乏;因此，寻找一种安全有效，费用低廉的重症肝病的治疗因此，寻找一种安全有效，费用低廉的重症肝病的治疗 方法就显得尤为迫切和重要方法就显得尤为迫切和重要Polson J, et al. The management of acute liver failure. Hepatology, 2005, 41(5):1181 干细胞干细胞(stem cell)是目前医学、生物组织工程学等领域研究的热点之一是目前医学、生物组织工程学等领域研究的热点之一;间充质干细胞间充质干细胞(mesenchimal stem cells, MSCs)广泛应用于心血管、骨骼、 神经、造血及肾脏系统疾病的治疗广泛应用于心血管、骨骼、 神经、造血及肾脏系统疾病的治疗;研 究 背 景研 究 背 景Heydarkhan-HS, et al. Cell Tissues Organs, 2008; 187(4): 263 De GL, et al. Int J Artif Organs, 2008; 31(6): 467. Sabrina C, et al. Cell Biology International, 2007; 31(8):845. Perin L, et al. Pediatr Res, 2008 Jan 24 研 究 背 景研 究 背 景MSCsMSCs 在肝脏病治疗中的应用在肝脏病治疗中的应用在肝脏病治疗中的应用在肝脏病治疗中的应用? ? 20062006年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育人类肝脏组织人类肝脏组织人类肝脏组织人类肝脏组织; ;? ?国内外国内外国内外国内外自体骨髓自体骨髓自体骨髓自体骨髓MSCsMSCs已经应用于对晚期肝病的已经应用于对晚期肝病的已经应用于对晚期肝病的已经应用于对晚期肝病的治疗治疗治疗治疗( (临床实验临床实验临床实验临床实验); );高志良, 彭亮, 崇雨田等。

中华传染病杂志, 2007, 3(25): 181.Pai M, et al. Am J Gastroenterol , 2008 Jun 30.我科干细胞研究状况我科干细胞研究状况?基础研究基础研究 正常成人正常成人MSCs 肝衰竭患者肝衰竭患者MSCs 羊水干细胞羊水干细胞 肝衰竭肝匀浆蛋白对肝衰竭肝匀浆蛋白对MSCs肝细胞分化影响肝细胞分化影响?临床应用临床应用 肝衰竭患者的自体肝衰竭患者的自体MSCs移植治疗移植治疗基 础 研 究基 础 研 究生 物 学 特 性 诱导分化能力（肝细胞方向） 基 因 载 体生 物 学 特 性 诱导分化能力（肝细胞方向） 基 因 载 体正常成人正常成人MSCs肝衰竭患者肝衰竭患者MSCs羊水干细胞羊水干细胞比较比较比较比较研 究 基 础研 究 基 础正常正常MSC的分离，纯化，扩增的分离，纯化，扩增P1P5P15P0Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int (accepted)研 究 基 础研 究 基 础熟练掌握熟练掌握MSC的鉴定，多向分化诱导的鉴定，多向分化诱导研 究 基 础研 究 基 础MSC向肝细胞分化技术成熟向肝细胞分化技术成熟00.30.60.91.21.51.8036121800.30.60.91.21.51.80361218BUN (mmol/L)DayDayALB (ng/ug.d)Day12Day18MSC向肝细胞分化诱导向肝细胞分化诱导研 究 基 础研 究 基 础研 究 基 础研 究 基 础羊水羊水MSCs与骨髓与骨髓MSCsOct-4基因表达水平的比较基因表达水平的比较Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int (accepted)研 究 基 础研 究 基 础羊水羊水MSCs与骨髓与骨髓MSCs向肝细胞诱导分化能力的 比较向肝细胞诱导分化能力的 比较 AFMSCsAFMSCsBMMSCsBMMSCsAFMSCsAFMSCsBMMSCsBMMSCsYu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int (accepted)研 究 基 础研 究 基 础羊水羊水MSCs与骨髓与骨髓MSCs细胞遗传学部分研究细胞遗传学部分研究Yu Bao Zheng, Zhi Liang Gao. Cell Biol Int (accepted)免疫组化检测免疫组化检测HBsAg、、HBcAg表达表达巢式巢式PCR检测检测HBV DNA及及cccDNAMSCs尚未受到尚未受到HBV感染，并与乙肝病毒复制活跃程度无关感染，并与乙肝病毒复制活跃程度无关体外以体外以HBV DNA阳性血清培养，阳性血清培养， MSCs亦不易受到亦不易受到HBV感染感染研 究 基 础研 究 基 础乙肝肝衰竭患者乙肝肝衰竭患者MSCs的的HBV感染状况研究感染状况研究研 究 基 础研 究 基 础对乙肝患者的对乙肝患者的BMMSCs安全性检测安全性检测(组化组化)HepG2HepG 2215HepG2 HBVP3P5Day18HBsAgHBcAgHBsAgHBcAgChan Xie, Zhi-liang Gao, BBRC (revised)肝衰竭模型大鼠血清、肝匀浆中 的促诱导蛋白分析肝衰竭模型大鼠血清、肝匀浆中 的促诱导蛋白分析实 验 方 案实 验 方 案大鼠大鼠MSCs肝衰竭大鼠血清肝衰竭大鼠血清肝衰竭大鼠肝匀浆肝衰竭大鼠肝匀浆肝细胞样细胞肝细胞样细胞形态观察形态观察蛋白表达蛋白表达糖原、糖原、BUN合成合成研 究 基 础研 究 基 础肝衰竭模型血清和肝匀浆诱导大鼠骨髓肝衰竭模型血清和肝匀浆诱导大鼠骨髓MSCs向肝细胞分化向肝细胞分化ALBALB血清组(×400 )肝匀浆组(×400 )研 究 基 础研 究 基 础肝衰竭模型血清和肝匀浆对大鼠骨髓肝衰竭模型血清和肝匀浆对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响体外增殖的影响MTT法检测不同浓度肝衰竭血清对BMSCs增殖的影响00.10.20.30.40.50.60.70244872肝衰竭血清作用的不同时间(h)492nm处 的 OD值正常血清组2.5％肝衰竭血清组5％肝衰竭血清组10％肝衰竭血清组20％肝衰竭血清组MTT法检测不同浓度肝衰竭肝匀浆对BMSCs增殖的影响00.10.20.30.40.50.60.70244872肝衰竭肝匀浆作用的不同时间(h)492nm处 的 OD值正常血清组1.0g/L肝匀浆组2.0g/L肝匀浆组4.0g/L肝匀浆组8.0g/L肝匀浆组研 究 基 础研 究 基 础凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭肝匀浆蛋白凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭肝匀浆蛋白123 4 566543 21研 究 基 础研 究 基 础凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭血清蛋白凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭血清蛋白43 21123 4研 究 基 础研 究 基 础肝衰竭肝匀浆聚丙酰胺凝胶电泳?第1波峰:集中在260KD～50KD；?第2波峰蛋白主要集中在220KD～50KD;?第3波峰蛋白主要集中在85KD～15KD；?第4波峰蛋白主要集中在85KD～12KD;?第5、第6波峰的蛋白在电泳中没有蛋白条带研 究 基 础研 究 基 础聚丙酰胺凝胶电泳蛋白条带大致分布研 究 基 础研 究 基 础MTT法检测肝衰竭肝匀浆蛋白对BMSCs增殖的影响00.10.20.30.40.50.60.70.80244872 培养时间(h)492nm处的OD值正常对照组 肝衰竭肝匀浆蛋白1组 肝衰竭肝匀浆蛋白2组 肝衰竭肝匀浆蛋白3组 肝衰竭肝匀浆蛋白4组初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响体外增殖的影响研 究 基 础研 究 基 础初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外肝细胞分化诱导体外肝细胞分化诱导AFP mRNA定量检测-1.8-1.6-1.4-1.2-1-0.8-0.6-0.4-0.200361218 培养时间(day)AFP mRNA相对表达量的lg值肝衰竭肝匀浆蛋白1组 肝衰竭肝匀浆蛋白2组 肝衰竭肝匀浆蛋白3组 肝衰竭肝匀浆蛋白4组 正常对照组ALB mRNA定量检测-4-3.5-3-2.5-2-1.5-1-0.500361218 培养时间(day)ALB mRNA相对表达量的lg值肝衰竭肝匀浆蛋白1组 肝衰竭肝匀浆蛋白2组 肝衰竭肝匀浆蛋白3组 肝衰竭肝匀浆蛋白4组 正常对照组研 究 基 础研 究 基 础分离纯化后肝匀浆蛋白对分离纯化后肝匀浆蛋白对MSCs作用作用? ?既有促进既有促进既有促进既有促进MSCsMSCs肝细胞的分化肝细胞的分化肝细胞的分化肝细胞的分化( (促分化作用促分化作用促分化作用促分化作用); );? ?同时还有对同时还有对同时还有对同时还有对MSCsMSCs增殖有抑制作用增殖有抑制作用增殖有抑制作用增殖有抑制作用( (毒性作用毒性作用毒性作用毒性作用); );(已整理成文待发表)下一步目标下一步目标下一步目标下一步目标研 究 基 础研 究 基 础?进一步分离血清及匀浆中促进进一步分离血清及匀浆中促进MSC向肝细胞分化的蛋 白和对增殖抑制的蛋白向肝细胞分化的蛋 白和对增殖抑制的蛋白;?再在这些蛋白质中寻找目的蛋白质，并进行蛋白测序再在这些蛋白质中寻找目的蛋白质，并进行蛋白测序;?如发现有新的蛋白或细胞因子，进一步检测它们的性质如发现有新的蛋白或细胞因子，进一步检测它们的性质;?分离纯化后蛋白应用于临床实验分离纯化后蛋白应用于临床实验.临 床 应 用临 床 应 用?第一代第一代：自体：自体MSCs移植治疗肝衰竭移植治疗肝衰竭(已施行已施行)?第二代第二代：自体：自体MSCs体外培养增殖后移植治体外培养增殖后移植治疗肝衰竭疗肝衰竭(研究中研究中)?第三代第三代：干细胞诱导分化为肝细胞后移植治：干细胞诱导分化为肝细胞后移植治疗肝衰竭疗肝衰竭(研究中研究中)?第四代第四代：各种干细胞：各种干细胞(羊水干细胞、基因改造羊水干细胞、基因改造后干细胞以及异体干细胞等后干细胞以及异体干细胞等)的移植的移植治疗肝衰竭治疗肝衰竭(设计研究中设计研究中)肝衰竭患者自体肝衰竭患者自体肝衰竭患者自体肝衰竭患者自体MSCsMSCsBiological characteristicsAutogeneic MSCsProliferation protocalDerivation protocalTransplantation the。