《组织培养》ppt课件.ppt

Chapter 3 培养基,培养基的成分 培养基的配制 培养基的筛选,培养基(culture medium)的配制是组培工作的核心外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化，其主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功事实上，培养基的研制始终伴随着组培技术的发展，整个组培的发展史就是一部培养基的研制史： 1902 Haberlandt knop培养液＋Suc 失败 1934 White 等人 无机＋有机（ VB）＋ IAA 脱分化 1957 Skoog & Miller CYT/IAA 激素调控 再分化 1958 Steward 首次实现植株再生 里程碑 1965 Vasil 成分已知的合成培养基 单Cell 培养基的名称，一直根据沿用的习惯多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。

一、培养基种类,各种培养基都是建立在White和Gautheret培养基基础之上的培养基数目之多到无法统计的地步常用培养基不下几十种二、培养基特点,1.MS培养基：无机盐和离子浓度较高，比较稳定的离子平衡溶液养分数量和比例较合适，硝酸盐含量较其他培养基高，广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养 2.B5培养基：含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用，双子叶特别是木本植物适合于B5培养基3. White：无机盐数量较低，适合于生根培养 4.NT培养基：适合于烟草叶肉原生质体培养 5.KM-8P培养基：有机成分较复杂，包括了所有的单糖和纤维素、呼吸代谢中的主要有机酸广泛应用于原生质体和细胞融合的研究 6.N6培养基：成分较简单，且KNO3和(NH4)2SO4含量高，应用于花药培养和组织培养三、培养基成分,1、基本培养基：提供组织生长的基础营养物质 基本培养基＝无机＋有机 2、培养基的成分： 培养基=无机＋有机＋激素＋固化剂＋其它,1）无机成分 ①大量元素（0.5mmol/L 或 100mg/L ）: N、 P、K、Ca、Mg、S； ② 微量元素（0.5mmol/L 或 100mg/L ）: 铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、钴(Co)、氯(Cl)。

2）有机成分,有机成分（organic compound）：指植物生长发育时必需的有机碳、、氢、氮等物质主要有糖、维生素、肌醇、氨基酸等①糖（sugar）,糖既可作为碳源，为培养的外植体提供生长发育所需的碳骨架和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用常用蔗糖，浓度为1～5%②维生素（vitamin）,维生素类化合物在植物细胞里主要以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用使用量通常为0.1～1.0mg/L③肌醇（inositol）,肌醇能帮助活性物质发挥作用，使培养组织快速生长，促进胚状体及芽的形成用量一般为50～100mg/L④氨基酸及有机添加物（amino acid and organic addition）,一种重要的有机氮源，除构成生物大分子的基本组成外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外植体芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用天然复合物,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用由于成分复杂，实验可重复性差，应尽量不用或少用 但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果 常用的有：CH（水解酪蛋白）、CM（椰子汁）、ME（麦芽浸提物）、YE（酵母浸提物）、TJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯……,1)椰乳（CM） 是椰子的液体胚乳。

它是使用最多、效果最大的一种天然复合物一般使用浓度在10%—20%，与其果实成熟度及产地关系也很大它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用 2)香蕉（banana） 用量为150-200ml／L用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色对pH值的缓冲作用大主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用用量为150—200g／L对pH值缓冲作用也大添加后可得到健壮的植株 4)水解酪蛋白（CH） 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100—200mg／L受酸和酶的作用易分解，使用时要注意 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%～0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效实验设想：目前已经组培成功的植物只有4000余种，对一些难于培养的植物种类，可否将其组织捣碎，分离汁液作为培养基的添加剂，以其有所突破？,3）植物生长调节物质（plant growth regulator）,对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起重要和明显的调节作用。

①生长素类（auxin）,促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导愈伤组织形成，促进生根常用生长素有IAA、NAA、IBA和2,4-D，作用强弱依次为2,4-D＞NAA＞IBA＞IAA②细胞分裂素（cytokinin）,促进细胞分裂，抑制衰老，由愈伤组织或器官上分化不定芽常用的细胞分裂素有激动素(KT)、异戊烯基腺嘌呤(2iP)、6-苄基腺嘌呤(BAP)、玉米素(Zt)、噻重氮苯基脲(TDZ)，作用强弱依次为TDZ＞Zt＞2iP＞BAP＞KT③其他类,除了生长素和细胞分裂素外，赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、多效唑（PP333）和乙烯类等4）其他附加物,琼脂：使培养基固化，防止培养物浸入培养液中导致缺氧而死亡使用浓度一般为0.6～1% 活性炭：吸附有毒、有害的化合物5）pH值,培养基的pH值在高温高压灭菌前一般调至5.0～6.0，pH值高于6.0时，培养基会变硬，低于5.0时，琼脂凝固效果不好四、 培养基的选择,培养基＝基本培养基 ＋ 植物激素 （物质基础 ） （调控手段） 生存 ←→ 发展 培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现离体细胞的生长、分化与植株再生。

而最佳组合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效果在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始当通过一系列的实验，对这种培养基的物质种类、用量、比例关系作出适当调整后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基选择最佳培养基，常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等1、单因子试验 在试验中，培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，通过试验可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度这种只研究一个因素的试验就是单因子试验例：以MS为基本培养基，分别对BA和NAA作单因子分析： MS＋BA2＋NAAm （0.1、0.5、1.0） MS+BAn+NAA0.1 （0.5、1.0、2.0） 局限性：探索范围难于把握，不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响2、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验 试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合 例如研究NAA和6-BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验。

2种激素5种浓度的实验组合,完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验例如，采用正交设计，在使用L9表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种搭配的试验在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量例如：A、B、C、D四个变动因子，各有1、2、3三种不同水平，则可如图设计实验：对结果进行方差分析与显著性分析即可了解4种不同因子的影响力3、逐步添加和逐步排除的试验方法： 在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法4、广谱实验法 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。

对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同科学安排研究顺序： ①基本培养基的选择： 通常会以一种或几种已知的基本培养基为起点，通过实验确定出合适的营养物质水平 ②激素配比的选择： 通过单因子分析、多因子实验、正交实验等方法确定出最佳激素配比模式③糖浓度的选取： 大多数植物2％或3％，少数4％；花药培养时糖浓度要求较高，7％－15％，其主要作用在于调节基质渗透压 ④PH值的选取： 植物组织对PH值要求不高，一般pH5.6-5.8，个别喜酸或喜碱，可结合植物的生长习性适当调整，也可通过单因子分析加以确定5、综合因子的确定： 在各个单项因子的条件找到以后，综合进行全面实验，并根据实验情况作出适当调整，即可确定出最佳培养基配方五、培养基的制备,1.母液的配制,优点：1）可减少每次配制称量药品的麻烦；2）减少极微量药品在每次称量时造成的误差。

1）大量元素混合母液,配制成10倍的母液 1）各化合物必须充分溶解后才能混合； 2）混合时注意先后顺序，特别要将Ca2+、Mn2+、Ba2+和SO42-、PO43-错开，以免产生沉淀 3）混合时要慢，边搅拌边混合2）微量元素混合母液,除了Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等盐类的混合溶液，因含量低，一般配制成100倍，也要注意顺序溶解后再混合，以免沉淀3）铁盐母液,将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解，然后将2种溶液混合，把pH调到5.5，加蒸馏水至1L，可配成100倍或200倍母液4）有机化合物母液,主要是维生素和氨基酸类物质，可配制成100×或200×5）植物激素,每种激素必须单独配制成母液，浓度为每毫升含0.1、0.5、1.0mg激素，用时根据需要取用，激素一般浓度表示方法为mg/ml2.培养基的配制,1）融化琼脂 称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水到培养基最终体积的2/3，加热使之溶解 2）混合培养基中各成分，依次加入大量、微量、铁盐和。