超详细酶促反应动力学实验.pdf

酶动力学综合试验 试验（一）碱性磷酸酶 Km值的测定 【目的要求】 1.明白底物浓度对酶促反应速度的影响 2.明白米氏方程， Km 值的物理意义及双倒数作图求 【试验原理】 1，碱性磷酸酶： Km 值的方法； 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多；其次为肾脏， 骨骼，肠和胎盘等组织；但它不是单一的酶，而是一组同功酶；本试验用的碱性 磷酸酶是从大肠杆菌中提取的； 2，米氏方程： Michaelis-Menten 在讨论底物浓度与酶促反应速度的定量关系时， 应动力学的基本公式，即： 错误！未找到引用源； 式中： v 表示酶促反应速度， 导出了酶促反 (1) 错误！未找到引用源； S表示底物浓度， 错误！未找到引用源； 3， 错误！未找到引用源； 表示酶促反应最大速度， 表示米氏常数； 值的测定主要采纳图解法，有以下四种： 双曲线作图法（图 1-1，a） 依据公式（ 1） ，以 v 对s 作图，此时 1/2 错误！未找到引用源； 时的底物浓度 s 值即为 Km 值，以克分子浓度（ M）表示；这种方法实际上很少采纳，由于在实 验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和； 实测 错误！未找到引用源； 一个近似值， 因而 1/2 错误！未找到引用源； 数据要求较多，且不易绘制； 不精确；此外由于 v 对S的关系呈双曲线，试验 Lineweaver- Burk 作图法双倒数作图法（图 1-1，b） 实际工作中，常将米氏方程（式（ 1） ）作数学变换，使之成为直线形式，测定要 便利，精确得多； 其中之一即取 （1）式的倒数， 变换为 Lineweaver- Burk 方程式： 错误！未找到引用源； (2) y=ax+b 形式；此 以错误！未找到引用源； 对错误！未找到引用源； 作图，即为 时斜率为 错误！未找到引用源；，纵截距为 错误！ 未找到引用源；把直线外推与 横轴相交，其截距相交，其截距即为 Hofstee 作图法（略） 错误！未找到引用源； ； 把（ 2）式等号两边乘以 错误！未找到引用源； ，得： 错误！未找到引用源； (3) 以 v 对错误！未找到引用源； 作图，这时斜率为 错误！未找到引用源； ，纵截距 第 1 页，共 9 页 为错误！未找到引用源； ，横截距为 错误！未找到引用源； ； Hanas 作图法（略） 把（ 2）式等号两边乘以 S,得： 错误！未找到引用源； (4) 以 对s作图，这时斜率为 错误！未找到引用源； ，纵截距为 错误！未找到引用 源； （a） 本试验主要以双倒数法，即 详细原理如下： 本试验以碱性磷酸酶为例， (b) Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值； 用磷酸苯二钠为其作用物， 碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸，在相宜条件下（ PH10.0，和 60） ，精确反应 13 分钟；在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长 色泽深浅与光密度成正比；反应式如下： 620nm 比色；在肯定条件下 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度， 即以光密度的倒数作纵坐 标，以底物浓度的倒数作横坐标，按 Km 值； 【仪器与试剂】 仪器： Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 1. 2. 恒温水浴 721 型分光光度计 第 2 页，共 9 页 试剂： 1 酚试剂：称钨酸钠（ 错误！未找到引用源； W 错误！未找到引用源； 2 错 误！未找到引用源； O）100g，钼酸钠（ 错误！未找到引用源； Mo 错误！未 找到引用源；2 错误！未找到引用源； O）25g 置 1500mL 磨口回流装置内， 加蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 和浓硫酸 100mL；充分混匀，使其溶解；小 火加热，回流 10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出） ，再加入硫酸锂 （ LiSO4）150g，蒸馏水 50mL 及液溴数滴；在通风橱中开口煮沸 15min，以 除去余外的溴；冷却后定容至 1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任 何绿色；置棕瓶中，可在冰箱长期储存；如此贮存液使用过久，颜色由黄变 绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，复原原色仍可连续使用；使用时用蒸馏水 稀释一倍，最终酸度为 1N； 2 磷酸苯二钠基质液：称取 625mg磷酸苯二钠（ C6H5PO4Na2 .2H2O） ， 溶于 1,000ml 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱 内可储存一年之久； 3 碱性缓冲液（ pH10.0） ： 称取无水碳酸钠 及碳酸氢钠 ，溶解于蒸 馏水中，并稀释至 1,000ml. 4 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶 【试验步骤】 取 6 支试管按下表加入试剂： 1mg,加水 34ml，冰箱内可储存五周左右； 1 2 3 4 5 6 磷酸苯二 钠（ ml） 蒸馏水（ ml） 碱性缓冲液 （ml） - 混匀后， 60欲温 5 分钟 碱性磷酸酶液 （ml） - 混匀后， 60水浴 13 分钟（精确计时） 留意 ：1）加入碱性磷酸酶液要快速，精确；用移液枪加 2）此时为酶促反应，总体积 3）第六管不加酶； 酚试剂（ ml） 10%Na2CO3(ml ) 混匀后，室温放置 15 分钟 留意 ： 1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试 剂后酶促反应即停止； 2）Na2CO3 供应碱性环境，加入 Na2CO3 后试剂才显色 以 6 管为调零点，在 【结果处理】 620nm 波特长比色； 1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号 1 S 1/S 第 3 页，共 9 页 2 3 4 5 2 以 为纵坐标， 1/s 为横坐标，按 Lineweaver- Burk 作图，求出碱性磷酸酶 的 Km 值； 【留意事项】 1） 加入碱性磷酸酶的量要精确 2） 保温时间要精确 精确保温的方法：从第一管加入酶液开头计时，每隔 1 分钟向下一只试管加酶 液 ,直至加完，到精确 13 分钟立刻向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔 1 分钟向下一只试管加酚试剂 【摸索题】 ,直至加完止，这样保证每管精确保温 13 分钟； 1） 2） 3） 4） Km 的意义及其影响因子 为什么酶促反应速度以初速度表示 为什么 O.D 可直接代替 V 作图 分析自己的试验数据 试验（二）温度对酶活性的影响 【试验目的】 明白温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的熟悉； 【试验原理】 每种酶都有其最适温度， 高于或低于此温度酶的活性都降低； 一般而言， 如酶 处于过高的温度环境中， 会使酶活性永久丢失； 而如处于极低温度的环境中只会 使酶活性受到抑制，一旦温度相宜，酶又会全部或部分的复原其活性； 【仪器与试剂】 仪器： 1冰箱 4吸量管及吸量管架 7烧杯 2. 恒温水浴锅 5. 移液枪及枪头 3.试管和试管架 6.胶头滴管 试剂： 1 的缓冲液：量取 混合摇匀即可； 15.45ml 的 磷酸氢二钠和 的柠檬酸 20.5% 淀粉的 0.5% 氯化钠溶液： 可溶性淀粉和 氯化钠， 溶于 100ml 蒸馏水（需加热）； 3003175g/L 碘液 41M HCl 溶液 NaOH 溶液 6.稀释 100 倍的唾 液 【试验步骤】 7.冰水浴 第 4 页，共 9 页 1制管和预温 由于本试验对恒温反应要求较高， 故每个温度梯度使用两支试管， 分别标记 为 A 管和 B 管，同时欲温底物与酶； A 管加入 PH6.8 的缓冲液和 0.5%淀粉液； B 管使用移液枪加入稀释 5min； 100 倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温 取 12 支干净试管，参照下表加入试剂： 管号 的 缓冲液 （ ml） 含 NaCl 的 0.5% 淀粉液 （ ml） 稀释 100 倍的唾 液（ ml） 1（0） 2（室温） 3（37） 4（50） 5（70） 6（ 室温） 2 2 2 2 2 2 A 用 2ml 的蒸馏 水代替 2 2 2 2 2 B 1 1 1 1 1 1 *6 号管为对比组（比色时作为 0 号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代 替 2混合 A，B 管 将 1 号 A 管试剂快速加入温度对应的 B 管中 ( 为了最大限度保证酶的量 ) ，此 A 管 时为计时的起点（使用秒表） ，摇匀后放回对应温度连续水浴；留意：转移 试剂前需将其摇匀； 3时间掌握 然后每隔 1min 或 2min（时间自定）按上步操作依次把 A，B 管混合 ，严格掌握好时间； 4中止反应 2，3，4，5，6 号的 精确反应 13min，向 1 号管加入 2 滴 1M HCl 溶液，立刻混匀，中止反应， 按上一步的次序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架；后再各用 滴 1M NaOH溶液中和每管； 5显色 2 在每管中各加入 6比色 2ml 碘液并混匀，观看现象； 如不同温度梯度间现象差别不明显，就进行比色，通过光密度值来比较； 【结果处理】 记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析； 【留意事项】 严格留意时间的掌握及各物质的添加量； 【摸索题】 假如某同学 （没有严格依据教案步骤） 做出的试验结果为唾液淀粉酶的最适温度 为 70 度，请分析他得出这样的结果的可能缘由； 第 5 页，共 9 页 试验（三） PH 对酶活性的影响 【试验目的】 明白 PH 对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的熟悉； 对酶活性影响的机理： PH 影响酶活性中心的某些必需基团的解离 , 而这些 PH 影 PH 仍可以 基团往往仅在某一解离状态时才最简单同底物结合或具有最大催化活性； 响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态 , 从而影响酶对他们的亲和力； 影响酶活性中心的空间构象 , 从而影响酶的活性； 2. 本试验用唾液淀粉酶为材料来观看酶活性受 PH 的影响的情形；淀粉在该酶 的催化作用下会随着时间的延长而显现不同程度的水解 , 从而得到各种糊精乃至 麦芽糖 , 少量葡萄糖等水解产物；碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应出现 不同颜色 , 即淀粉 ( 蓝色) ，紫色糊精 ( 紫色 ) ，红色糊精 ( 红色) ，麦芽糖及少量葡 萄糖 ( 黄色) ； 【仪器与试剂】 仪器： 1，冰箱 试管架及试管 5，移液管架及移液管 2，电炉 3，恒温水浴锅 4， 试剂： 1， 磷酸氢二钠溶液：称取 定容至 1L； 35.61g 含 2 个结晶水的磷酸氢二钠，用水 2，0.1M 柠檬酸溶液： 称取 21.01g 含一个结晶水的柠檬酸， 用水定容至 1L； 3，唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 的酶液， 10 倍， 50 倍和 100 倍，得三种不同浓度 4，0.5% 淀粉的 0.5% 氯化钠溶液： 可溶性淀粉和 氯化钠， 溶于 100ml 蒸馏水（需加热）； 5， 0.1% 淀粉液： 可溶性淀粉，加到 100ml 蒸馏水中，加热溶解； 6，碘液： 15g 碘化钾和 至 200ml ； 7， 1% 氯化钠溶液； 8， 0.1% 硫酸铜溶液； 【试验步骤】 （一） PH 对酶活性的影响 1，缓冲溶液的配制 取六只干净的三角烧瓶，按表 12.7g 碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释 1 编号和加试剂： 表 1 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液的配制 第 6 页，共 9 页 取六支干净试管，编号后按表 2 操作： 表 2 pH 对酶活性的影响 【结果处理】 记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析； 【留意事项】 充分摇匀，严格掌握时间； 【摸索题】 酶的最适 PH 值受哪些因素影响？ 三角烧瓶号 PH 值 1 2 3 4 5 6 磷酸二氢钠（ 柠檬酸（ ml） ml） 管号 PH 值 缓冲液量（ 1 3 2 2 2 3 2 2 3 3 2 2 4 3 2 2 5 3 2 2 6 3 2 2 ml） 含 Nacl 的 0.5%淀粉（ ml） 稀释 100 倍唾液（ ml） 充分摇匀， 37水浴保温，严格掌握时间 5min 后，立刻向各管加入碘液 碘液（滴） 3 3 3 3 3 3 充分摇匀，观看各管颜色差异 试验（四）酶浓度对。