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肠球菌耐万古霉素的机理及其检出方法国外医学临床生物化学与检验学分册 1999 年第 20 卷第6期天津市公安医院（300050） 蒋云华 王金良关键词：肠球菌 万古霉素自1988年英国首次发现耐万古霉素的肠球菌（VER）后，在全球迅速传播，且发展为多重耐药，使临床治疗极为困难文献报告VRE所致的亚急性 细菌性心内膜炎、败血症、盆腔内感染、尿路及伤口感染等日益增多VRE也是重要的医院内感染菌，已占医院内感染菌的第4位对人类更具威 胁性的是万古霉素依赖性肠球菌（VDE）出现，文献中至少已报告6例感染因此，及时检出VRE、VDE，对抢救感染患者，合理使用抗生素以及流 行病学调查均具重要意义1 肠球菌耐万古霉素的分子生物学机制万古霉素属糖肽类抗生素（包括替考拉宁、多糖菌素、杆菌肽等）系高分子量疏水化合物，它可与肠球菌细胞壁上的五肽糖前体的羧基末端D-丙氨 酸-D-丙氨酸结合形成复合体，从而阻抑了肽糖聚合所需的糖肽基和转肽反应，使肠球菌不再能合成细胞壁而死亡VRE由于基因改变，使细胞壁的 肽糖前体末端改变为D-丙氨酸-D-乳酸盐，万古霉素即失去与之结合能力，肠球菌可照常合成细胞壁而存活导致VRE形成的基因为分VAN A、VAN B、VAN C和VAN D基因型。

VAN A、VAN B基因为获得性，VAN C基因为固有，VAN D基因与前两者的结构与 作用相似，但临床意义尚不明确（表 1）SahmDF用BEAA （胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）筛查2777份标本（2264份尿、513份粪便），2394份（86% ）无肠球菌生长，共筛查出206株肠球菌， 来自121名患者经基因分析，其中61株（50% ）含Van A基因，9株含Van B （7%），6株含Van A和Van B （50%），38株Van C （31%），其中33株含Van C1，5株含Van C2，含Van A、B者均为粪肠球菌表 1 肠球菌耐糖肽药物的基因型获得性内源性Van AVan BVan C(C1 C2/C3)Van D万古霉素MIC（mg/L）64 〜＞10004 〜＞10002〜3216 〜64替考拉宁MIC（mg/L）16 〜5120.5 〜10.5 〜12〜4表达可诱导可诱导不定临床基因位置质粒染色体或质粒染色体意义转移元件Tn154690-250Kb尚未表型接合转移++确定修饰靶位D-Ala-D-LacD-Ala-D-LacD-Ala-D-Ser菌株尿肠球菌尿肠球菌鸡肠球菌部分尿、粪肠球菌粪肠球菌粪肠球菌菜黄、黄色肠球菌鸟、坚韧、鸡孟氏，黄色鼠李糖、菜黄肠球菌Toye等用PCR法自601份粪便检出了 34株（5.7%） Van C的VRE,自非粪便标本538份中检出了 9株（1.7%），且证明Van C不在病人间转移,不必筛查。

2 基因手段检出 VRE 及方法等比较Endtz等用8种人工与仪器的方法检测VRE，与PCR法检查基因型相比较基因型为Van A者50株，Van B者15株，Van C150 株, Van C238 株, 共145株，万古霉素敏感者50株为对照，结果发现不同方法对不同基因型的检测与NCCLS琼脂称释法相比有很大、大和小的错误（表2）表 2 七种方法检测 VRE 的错误率错误率（％）方法很大大小Van A(n=50)Van B(n=15)Van C1(n=50)Van C2(n=30)(n=50)Van A(n=50)Van B(n=15)Van C1(n=50)Van C2(n=30)E试验0000001320纸片扩散000020275037琼脂筛查00004Microscan普通板00030002490快速板0330000271410Vitek GPS-7A0400040132837GPS-10100004271230表中有“很大的错误”：指参考琼脂稀释法为耐药，而此法测出敏感者大错误”：指参考的琼脂稀释法为敏感，而此法则为耐药者小错误”： 指两法之间有差异的结论是E试验和琼脂筛查试验适合检出全部的VRE （包括Van C1/C2）。

Jorgensen等也推荐万古霉素筛查法，培基应用脑心浸液（BHI）含6“ g/ml万古霉素，细菌接种量应为105或106CFU,可以点种，也可用0.5McFarland药液以棉拭涂布，任何生长的肠球菌均判为VRE，此法可检出Van A、B、C的基因型Rohner 等比较 6 种方法检测耐万古霉素的类型 1）琼脂筛查法分别用 BHI 和 MH 培基2）肉汤稀释法分别用 BHI 肉汤和调正离子的 MH肉汤（CAMUB）°（3）琼脂稀释法分别用BHI和MH培基4） E试验分别用BHI和MH琼脂5）纸片扩散法分别应用BHI和MH琼脂6）自动仪器法用Vitek仪器、GPS-SA卡片和Ro2.03软件分析经比较100株肠球菌［包括34株尿肠球菌、43株粪肠球菌、11株鸡肠球菌、10株Casscliflavus/flavescer （菜黄/黄色），1株鸡肠球菌、1株鼠李糖球菌］,参考菌株用屎链球菌ATCC29212, ATCC51299比较结果最佳者为应用BHI的肉汤稀释法，应用BHI的琼脂稀释法及BHI的E试验，判定时间均应用24h,而NCCLS现规定应用MH琼脂的纸片法或MH琼脂的筛查法均不完善。

Sahm等人则提倡筛查VRE时应用SBA琼脂（胰酶大豆汤加5%羊血）最好3 多重 PCR 法检测 VRE 的基因型多重PCR法Dutka-Malen等曾详细介绍该方法，可在4h内完成，Satake等直接用肛内拭子取粪便提取DNA,经纯化后进行多重PCR,同时测VanA、B、C1、C2，应用四对引物，产物分别为 Van A732bp（1429bp）,特异性 99.6%，Van B635bp，Van C1822bp, Van C2484bp（C2/C3439bp）检出 VRE 的基因型比较可用酶切（Smal ）的PFGE法分析，可多达36种电泳图形，用于流行菌株的确定4 应用表型与分子生物学结合的方法Sahm 建议的表型和分子生物学手段的流程如下：比乳检附超序标室按种1JLAAI胆汁七叶百叠題曲琼月的I 无菌躊英去苗落住仕革兰鱼色"茶兰阳性杆【眾告无'KU BSJIA + 万苗5素憑片（迢育 18-2411）（-）一（PYR）—（ 丫 } （ + 1—嚴控一（->报皆无和出 j 报吿務因塑 PCKI 1 或用表型理序抑菌环抑小环抑菌环6nun > 6 - 15moifilfi VKE无ViUi确毎多垂耐药・礎定BS*札5万古霉素依赖性肠球菌（Vancomycin-Depemdent Enterococi ，VIDE）临床分离的细菌曾出现过吡多醛依赖性肠球菌、链霉素依赖性大肠杆菌、替考拉宁依赖性肠球菌、链霉素依赖性分支杆菌，现发现耐万古霉素的肠 球菌（VER）的突变株可形成VDE，在粪、尿、鸟链球菌中均已出现。

万古霉素耐药基因转移给其他革兰氏阳性球菌，如葡萄球菌的潜在可能性具有 很大威胁，应引起临床细菌学工作者高度警惕Fraimov等首先报告自临床分离的VDE，系自尿中分离的含VanB基因的屎链球菌且经过长时间的万古霉素治疗VDE的生长需万古霉素或D-丙氨酸-D-丙氨酸（DADA），其机制与DADA连接酶基因突变有关，少数VDE可自然逆转为非依赖性，逆转频率为1X10-6文献中已报告有6例VDE的感染所报告的 6例均与长期抗菌治疗有关，且4例为肾病患者作者患者临床分离株Fraimov H 等长期住院者尿、Van B屎肠球菌Woosford N 等二例肾疾患粪、尿肠球菌Groen M 等移植血Van B粪肠球菌Rosato A 等肾脓肿粪Van A鸟肠球菌Dever L 等看护院老者粪Van B粪肠球菌Sng等肾疾患血Van B粪肠球菌培基表面加万古霉素纸片，如周围有肠链球菌生长，提示为VDE,再进一步确定其药敏试验需在培基中加入万古霉素，但会干扰结果的判定， 故Sng等倡用DADA，其浓度以1000pg/mL为佳Sng等发现用此法测VDE对多种抗生素的MIC在24h观察结果，除对万古霉素耐药外，均为敏感，这是因为VDE生长缓慢，在48h读取结果，则利 福平、高浓度链霉素、quimpristin/dolfopri Stin杀菌效果最佳。

Sng等用PCR-RFLP分析分析自患者分离的VRE、VDE，其自然逆转株及患者的尸检株显示为同一菌株，充分肯定VRE已转变为VDE。